Produção de L-asparaginase pela levedura Leucosporidium muscorum CRM 1648 isolada de sedimento marinho coletado na Península Antártica / L-asparaginase production by the yeast Leucosporidium muscorum CRM 1648 isolated from marine sediments collected in Antarctic Peninsula

L-asparaginase (L-ASNase) é uma enzima com propriedades interessantes para a indústria médica, farmacêutica e de alimentos, que tem recebido atenção especial, inclusive no Brasil, por fazer parte do protocolo de tratamento de distúrbios linfoproliferativos, como a leucemia linfoblástica aguda (LLA). No mercado desde a década de 1970, as enzimas de origem bacteriana enfrentam algumas limitações por provocarem reações adversas graves em quase 80% dos pacientes em tratamento. Nesse contexto, L-ASNases provenientes de leveduras se destacam como alternativa, por serem mais próximas às congêneres humanas. A Antártica ainda é um ambiente pouco explorado, com grande diversidade de microrganismos com potencial para a produção de moléculas biológicas de interesse industrial. Nesse contexto, 150 leveduras isoladas de amostras de sedimento marinho coletadas na Península Antártica como parte do projeto MICROSFERA (PROANTAR/CNPq) foram avaliadas para a produção de L-ASNase. A triagem resultou em 9 isolados produtores, dos quais 7 pertencem ao gênero Leucosporidium. A linhagem L. muscorum CRM 1648 foi a que produziu mais enzima (540 U.L-1), com maior produtividade (5,6 U.L-1.h-1) e, por isso, foi alvo deste estudo. A análise univariada de fontes de carbono e nitrogênio indicou maior crescimento desse microrganismo e produção de L-ASNase em meio CD com extrato de levedura, prolina e sacarose. Ureia, cloreto de amônio e sulfato de amônio resultaram em baixa ou nenhuma produção da enzima, sugerindo que a metabolização de fontes de nitrogênio por essa linhagem está sob a influência do fenômeno de repressão catabólica pelo nitrogênio (RCN). Dois delineamentos experimentais do tipo fatorial completo resultaram em um aumento de 10 vezes na produção e produtividade da enzima (4582,5 U.L-1 e 63,6 U.L-1.h-1, respectivamente). A análise univariada da concentração inicial de inóculo (X0), pH inicial do meio, temperatura e adição de água do mar mostrou que a melhor condição para a produção foi: pH = 5,5 ou 6,5, cultivo a 15°C com adição de água do mar (25-50% m/v). A variável X0 não foi significativa nas concentrações avaliadas. Cultivos em biorreator (batelada) foram conduzidos em quatro diferentes níveis de oxigênio dissolvido (OD): (1) OD não controlado e abaixo de 20%, (2) OD não controlado e acima de 20%, (3) OD controlado em 80% e (4) OD controlado em 20%. Os resultados mostraram que OD é fator limitante para o crescimento de L. muscorum CRM 1648 e produção de L-ASNase por essa levedura e deve ser mantido acima de 35% para maior produção da enzima.Neste trabalho, a composição do meio e condições de cultivo foram estabelecidas para favorecer a produção de uma nova L-ASNase livre de atividade glutaminásica por levedura adaptada ao frio, abrindo espaço para novos estudos acerca de seu potencial antileucêmico e possível uso como alternativa às enzimas já existentes no mercado no tratamento de LLA

L-asparaginase (L-ASNase) is an enzyme with interesting properties for medical, pharmaceutical and food industry, which has received special consideration, especially in Brazil, for being part of lymphoproliferative disorders treatment, such as acute lymphoblastic leukemia (ALL). Bacterial enzymes are on the market since the 1970s and face some limitations related to theirserious adverse reactions that reach almost 80% of all patients in treatment. In this context, L-ASNases from yeasts are highlighted as important alternative to bacterial enzymes, due to the closerphylogeny to human congeners. Antarctic environment has much to be explored, with a vast diversity of microorganisms with potential to produce biomolecules with industrial interest. A total of 150 yeasts isolated from Antarctic marine sediments as part of MICROSFERA project (PROANTAR/CNPq) were evaluated for L-ASNase production. The screening resulted in 9 producers, 7 species from the genus Leucosporidium. L. muscorum CRM 1648 was the strain that yielded the highest L-ASNase activity (540 U.L-1) and volumetric productivity (5.6 U.L-1.h-1). Carbon and Nitrogen sources were evaluated by a method of one-factor at a time (OFAT). From the gather results, sucrose, yeast extract and proline resulted in a maximal growth and highest enzyme production.The absence or low production of L-ASNase in medium with urea, ammonium chloride and ammonium sulfate suggests the presence of nitrogen catabolic repression (NCR). Carbon and nitrogen concentration were evaluated by full factorial design and yielded about ten times higher enzyme and volumetric productivity (4582.5 U.L-1 and 63.6 U.L-1.h-1, respectively). Initial inoculum concentration (X0), initial pH, temperature and concentration of seawater in the culture were evaluated by OFAT analysis and the best condition for L-ASNase production was: pH = 5.5 or 6.5, at 15 °C with addition of seawater (25-50 wt%). X0 was not considered a significant variable. Bioreactor assays (in batch regime) were performed in four different dissolved oxygen (DO) levels: (1) without DO control (DO remained under 20%), (2) without DO control (DO remained above 20%), (3) DO controlled at 80%, and (4) DO controlled at 20%.The results showed that DO is a key factor for growth of L. muscorum CRM 1648 and production of L-ASNase by this yeast and should be maintained above 35% for higher production of this enzyme.At this work, the medium and culture conditions were established to support the production of a novel glutaminase-free L-ASNase by a cold adapted yeast, opening a new path for further studies regarding its antileukemic potential and possible use as an alternative for ALL treatment

Avaliação da resistência de formas mutantes da enzima L-asparaginase a proteases séricas humanas / Evaluation of L-asparaginase mutant forms resistance to human serum proteases

O tratamento para a Leucemia Linfoblástica Aguda LLA utiliza, entre outros fármacos, a enzima L-asparaginase (ASNase) proveniente da bactéria Escherichia coli. Reações imunológicas estão entre os problemas do tratamento com ASNase, e a formação de anticorpos contra essa proteína pode impedir o sucesso no tratamento. Duas cisteíno proteases lisossomais estão relacionadas com a degradação de ASNase nos seres humanos, a Catepsina B (CTSB) e Asparagina Endopeptidase (AEP). Em estudos prévios do nosso grupo obteve-se mutantes de ASNase resistentes a degradação por CTSB e/ou AEP in vitro. Nesse trabalho avaliamos essas mutantes quanto a sua citotoxicidade em linhagens celulares de leucemia e conduzimos estudos in vivo, aplicando as proteoformas de ASNases em camundongos Balb C para avaliar a atividade asparaginase sérica das enzimas ao longo do tempo, bem como obter informações sobre a formação de anticorpos contra essas proteoformas. Nos ensaios de citotoxicidade, duas das proteoformas testadas tiveram efeito citotóxico semelhante a forma selvagem, enquanto uma outra proteoforma tem a citotoxicidade sensivelmente reduzida. Já nos ensaios in vivo, uma proteoforma demonstrou meia vida sérica maior da atividade asparaginásica, e duas proteoformas causaram reduzida formação de anticorpos. Juntos, esses resultados colaboram para a obtenção de uma nova geração de ASNases com melhor biodisponibilidade, e efeitos adversos reduzidos, gerando a possibilidade de menores doses e frequência de aplicações

The Treatment for Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) includes the biopharmaceutical L-asparaginase (ASNase) from Escherichia coli. Immunological reactions are among the problems of treatment using ASNase, and the antibodies formation protein may prevent success in treatment. Lysosomal cysteine proteases are related to ASNase degradation, Cathepsin B (CTSB) and Asparagine Endopeptidase (AEP). In previous studies, ASNase mutants resistant to CTSB and / or AEP degradation in vitro were obtained. In this work, mutants were evaluated in cytotoxicity in ALL cell lines and, in vivo studies, applying doses of the wild and mutant ASNases in Balb C mice to evaluate serum asparaginase activity of the enzymes over time, as well as to obtain information on the formation of antibodies against these proteoforms. Regarding to the cytotoxicity, two proteoforms among the tested had similar cytotoxicity than the wild-type. While another proteoform had the cytotoxicity severely reduced. One proteoform have demonstrated greater serum half-life of asparaginase activity, while two other mutants caused reduced antibody formation. Together, these results collaborate to obtain a new generation of ASNases with increased bioavailability and reduced side effects, generating the possibility of lower doses and frequency of applications

PEG-asparaginase induced severe hypertriglyceridemia

Asparaginase (ASP) is an effective chemotherapy agent extensively used in children with acute lymphocytic leukemia (ALL). There has been a recent interest in using ASP in adults with ALL, particularly the less toxic pegylated (PEG) formulation. Hypertriglyceridemia (HTG) is a rare complication of PEG-ASP therapy. We report two cases of obese patients who developed severe HTG after receiving PEG for ALL. Both patients were incidentally found to have severe HTG (TG of 4,330 and 4,420 mg/dL). In both patients, there was no personal or family history of dyslipidemia or hypothyroidism. There was no evidence of pancreatitis or skin manifestations of HTG. Both patients were treated with PEG cessation, low-fat diet and pharmacotherapy. Both patients were re-challenged with PEG, with subsequent increase in TG but no associated complications. TG returned to baseline after discontinuing PEG and while on therapy for HTG. A literature review of PEG-induced HTG in adults demonstrated similar results: asymptomatic presentation despite very severe HTG. HTG is a rare but clinically important adverse effect of PEG. Underlying obesity and/or diabetes may represent risk factors. Clinicians should monitor TG levels during PEG therapy to avoid TG-induced pancreatitis.

Hiperglicemia en niños con leucemia linfoblástica aguda en tratamiento con L-asparaginasa / Evaluation and characterization of hyperglycemia in children with acute lymphoblastic leukemia treated with L-asparaginase

Introducción: L-asparaginasa (L-asp), es un agente antineoplásico, entre cuyos efectos adversos se describe hiperglicemia dado que cada molécula de insulina tiene tres residuos de asparragina que son hidrolizados por L-asp, produciendo disminución de la síntesis de insulina con la consecuente hiperglicemia. Nuestro objetivo fue describir las características de la hiperglicemia asociada al uso de L-asp en niños en tratamiento por LLA. Pacientes y Método: Estudio retrospectivo que incluyó la revisión de historias clínicas de todos los niños, ingresados al Centro Valdivia, del Programa Infantil Nacional de Drogas Antineoplásicas, entre los años 2002 y 2009. Se evaluaron los antecedentes de los pacientes y aquellos que resultaron sospechosos de reacción adversa a medicamentos, se evaluaron según el algoritmo de causalidad de Karch y Lasagna. Resultados: Ingresaron al estudio 85 de 102 pacientes que reunieron los criterios de inclusión. La incidencia de hiperglicemia fue 6,74 por ciento. Los pacientes que presentaron hiperglicemia fueron aquellos con edad mayor a 9,5 años, riesgo de obesidad, antecedentes familiares de diabetes Diabetes Mellitus y tratamiento concomitante con corticoides. Conclusión: Las características de los pacientes con hiperglicemia en tratamiento con L-asp coinciden con los de la literatura. La administración simultánea de corticoides y L-asp dificulta la determinación de causalidad de L-asp, por lo que es importante que se continúe en el futuro con esta línea de investigación.

Introduction: L-asparaginase (L-asp) is an antineoplastic agent that has among its adverse reactions, hyper-glycemia. Each insulin molecule has three asparagine residues which are hydrolyzed by L-asp, decreasing insulin synthesis and resulting in hyperglycemia. The objective of this study is to describe the characteristics of hyperglycemia associated with the use of L-asp in children with Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL). Patients and Method: A retrospective study that included review of medical records of all children admitted to Valdivia Center of the National Children's Antineoplastic Drug Program, between 2002 and 2009 was performed. Patient backgrounds were evaluated and those who were suspected to present adverse drug reactions were evaluated according to the causality classification of Karch and Lasagna. Results: 85 of 102 patients who met the inclusion criteria entered the study. The incidence of hyperglycemia was 6.74 percent. The patients with hyperglycemia were those older than 9.5 years of age, with risk of obesity, diabetes, family history of diabetes mellitus and concomitant corticosteroid treatment. Conclusion: The characteristics of hyperglycemia in patients treated with L-asp coincide with those of the literature. Simultaneous administration of corticosteroids and L-asp make difficult to determine causality of L-asp, so further research is needed.

Diabetes melito transitório relacionado à terapia com L-asparaginase / Transient diabetes mellitus related to L-asparaginase therapy

O tratamento de neoplasias hematológicas malignas com L-asparaginase tem sido associado com o desenvolvimento de diabetes melito (DM) em cerca de 1-2 por cento dos casos. A associação com corticosteróides tem efeito sinérgico na ocorrência dessa complicação. Este artigo relata o desenvolvimento de DM transitório em uma adolescente de 13 anos, tratada com L-asparaginase e dexametasona devido a leucemia linfoblástica aguda. O DM foi diagnosticado 120 dias após o início da terapia com L-asparaginase, requerendo o uso de insulina por 12 meses. Investigação para auto-imunidade contra células beta pancreáticas foi negativa. Também não foram encontradas alterações laboratoriais sugestivas de pancreatite. O DM associado à L-asparaginase é insulinopênico e de caráter transitório, desaparecendo após a suspensão do medicamento. O diagnóstico do DM associado à L-asparaginase é baseado na associação temporal com o uso da droga e na exclusão de outras causas. Não existe um teste laboratorial capaz de diagnosticá-lo. Portanto, a investigação para DM tipo 1A, DM tipo 1B, DM induzido por corticoterapia e DM secundário a pancreatite tóxica é fundamental. O tratamento com insulinoterapia deve ser acompanhado de perto, uma vez que este tipo de diabetes tem um curso transitório.

Treatment of hematological malignancies with L-asparaginase has been associated with diabetes mellitus in about 1-2 percent of patients. The concomitant use of steroids has an additional deleterious effect. In this article, we report the occurrence of diabetes in a 13 year-old girl treated with L-asparaginase and dexamethasone for acute lymphoblastic leukemia. The diabetes developed 120 days after the drug was started, requiring insulin therapy for 12 months. Anti-islet autoantibody was negative, and there were no laboratory findings suggestive of pancreatitis. The DM related do L-asparaginase therapy is insulinopenic and transient, resolving with suspension of the drug. The diagnosis of this type of diabetes is based on its temporal relationship with the L-asparaginase and in the exclusion of other known causes. There is no laboratory test capable of elucidating the diagnosis. Therefore, investigation to rule out type 1A DM, type 1B DM, insulin-resistant DM induced by corticotherapy and DM secondary to toxic pancreatitis is of utmost importance. The insulin therapy must be followed closely, since this is a transient form of diabetes.

Reacciones adversas a L-asparaginasa en pacientes con leucemia linfoblástica aguda / Adverse reactions to L-asparaginase in children with acute lymphatic leukemia

Background: The low notification of Adverse Drug Reactions (ADR) underscores the need for pharmacological surveillance systems that allow their detection, evaluation, prevention and registry especially in patients receiving multiple medications. Aim: To communicate the ADR observed with the use E coli asparaginase (E coli ASP) in children with Acute Lymphatic Leukemia (ALL). Patients and Methods: Cross-sectional study of clinical records of all the patients aged less than 15 years with ALL (n =52) and treated between January 1996 and April 2000. The suspicion of ADR to E coli ASP was evaluated using the Karch and Lasagna algorithm. Probable and definitive cases of ADR to E coli ASP were subjected to a protocol of clinical and epidemiological data. The risk factors associated to ADR to E coli ASP, were also determined. Results: Fifty children aged 1 to 13 years (33 men) were studied. In 20 (40 percent), an ADR to E coli ASP, was suspected. After the use of the algorithm, the ADR was considered definite in two patients, probable in 17 and possible in one. The registered clinical events were urticaria in 17, anaphylactic shock in four, transient alterations of hepatic functions test in seven and hypofibrinogenemia in four. The test of cutaneous sensitivity to the administration of E coli ASP, performed prior to the administration of the drug, were positive in nine of the 20 children with adverse reactions. No children died. Conclusions: The application of the Karch anbd Lasagna algorithm, allowed us to objectively classify suspected cases of ADR by E coli ASP.

Complicações tromboembolíticas da leucemia linfoblástica aguda em crianças e adolescentes: efeitos da doença e do tratamento sobre o sistema hemostático / Thromboembolic complications of acute lymphoblastic leukemia in children and adolescents: effects of the disease and the therapy on the hemostatic system

O recente aumento na incidência dos eventos tromboembólicos e a necessidade de seu tratamento em crianças e adolescentes têm justificado o desenvolvimento de estudos e programas específicos. As tromboses são causas importantes de morbidade e mortalidade em pacientes com câncer. Em especial, na leucemia linfoblástica aguda (LLA) da infância, o tromboembolismo é uma complicação grave que ocorre em conseqüência da interação entre a doença, o hospedeiro e o tratamento. Este estudo teve por objetivos avaliar prospectivamente o comportamento dos marcadores de ativação da coagulação e das proteínas anticoagulantes naturais em pacientes com LLA no momento do diagnóstico e durante o tratamento de indução de remissão. Correlacionar os resultados da avaliação da hemostasia com a ocorrência de eventos tromboembólicos e com a presença da mutação G1691A do fator V e do polimorfismo G20210A do gene da protrombina. No período de fevereiro a novembro de 2003 foram avaliados 16 crianças e adolescentes com diagnóstico de LLA admitidos na Unidade de Oncologia do Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. As avaliações clínicas e laboratoriais foram realizadas no momento do diagnóstico, durante e ao final do tratamento de indução de remissão (Protocolo GBTLI LLA-99) / The recent increase in the incidence of thromboembolic events and the need of treatment in children and adolescents justify the development of specialized programs to provide optimal management. Thromboembolic disease is a major cause of morbidity and mortality in cancer patients. Especially in acute lymphoblastic leukemia (ALL) of infancy, thromboembolic events are severe complications that occur as a result of the interaction of the disease, the host and the treatment. The main purpose of this study was to evaluate thrombin generation and thrombin inhibitors in patients with ALL at presentation and during the induction therapy...

Toxicidad a la L-asparaginasa en pacientes con leucemia aguda linfoblástica / Toxicity to L-asparaginase in patients with acute lymphoblastic leukemia

Antecedentes. La L-asparaginasa es una enzima extraída de Erwinia caratovora y Escherichia coli que ha sido aceptada para el tratamiento de inducción y consolidación en pacientes con leucemia aguda linfoblástica (LAL) y linfoma no Hodgkin; produce una prolongada remisión. Material y métodos. En el Hospital Infantil Privado en un periodo de dos años (1990-1992) se estudiaron 20 pacientes con LAL; recibieron L-asparaginasa; se registraron las complicaciones, la frecuencia y el tiempo de aparición de éstas. Resultados. Un paciente presentó hipersensibilidad tipo l (rash, rubicundez, broncoespasmo, etc.); otro tuvo hiperglicemia, pancreatitis y hemorragia cerebral fatal. En 13 casos hubo plaquetopenia. Hubo tres defunciones por hemorragia cerebral tres semanas después de la aplicación del medicamento; uno de estos pacientes tuvo tiempo parcial de tromboplastina prolongado y otro, alteración del fibrinógeno. Conclusiones. La L-asparaginasa es útil y necesaria para alargar el tiempo de remisión de la LAL. Los pacientes que reciben L-asparaginasa deben ser vigilados estrechamente para detectar hipersensibilidad tipo l, hipofibrinogenemia, hipergilcemia, hiperamonemia, pancreatitis o quiste pseudopancreático

Diabetes mellitus secundaria al uso de L-asparaginasa en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda / Diabetes mellitus secondary to L-asparaginase use in the treatment of acute lymphoblastic leukemia

La L-asparaginasa es una droga utilizada para inducir remisión en la Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA). Uno de sus efectos adversos es la hiperglicemia que se describe hasta en el 10 por ciento de los pacientes, siendo más frecuente en niños mayores de 10 años, obesos y portadores de síndrome de Down. Presentamos dos pacientes con una LLA que desarrollaron hiperglicemia. El primero, un niño de 9 años portador de un síndrome de Down que después de la tercera dosis de L-asparaginasa cursó con una diabetes mellitus transitoria necesitando insulina durante 35 días. El segundo, una adolescente de 14 años que luego de la octava dosis de L-asparaginasa cursó con un pancreatitis aguda y diabetes mellitus insulino dependiente. Recomendamos que a todos los pacientes portadores de una LLA y en tratamiento con L-asparaginasa se les determine glicemia y glucosura previo a cada dosis y con mayor razón en los pacientes con factores de riesgo

L-asparaginase related hyperglycemia.

L-asparaginase is a valuable chemotherapeutic agent used in the induction of remission and improvement of long term survival in patients with acute lymphoblastic leukemia. Hyperglycemia is a well known side effect of L-asparaginase. Fourteen patients developed hyperglycemia during induction therapy of acute lymphoblastic leukemia with L-asparaginase, prednisolone, vincristine and daunorubicin. Hyperglycemia was observed after a mean of five doses of L-asparaginase (range 2-10). Seven of fourteen patients had neutropenic related infective episodes. Hyperglycemia resolved in all patients within 12 days (range 4-25) and two patients died of neutropenic septicemia. During reinduction therapy with the same drugs, only one out of ten patients developed hyperglycemia E-coli-L-asparaginase was replaced by Erwinia asparaginase in two patients one of who had recrudescence on further therapy. Close monitoring during L-asparaginase therapy for hyperglycemia will enable prompt recognition and early correction and prevent delay in therapy of acute lymphoblastic leukemia.