Padronização de um teste ELISA indireto para diagnóstico da cinomose canina / Standardization of an indirect ELISA test for canine diagnosis diagnosis

A cinomose é uma enfermidade causada pelo vírus Canine Distemper Virus (CDV). Essa doença afeta principalmente cães, mas também acomete outras espécies domésticas e selvagens. A imunidade do animal está relacionada ao grau que a esse patógeno vai atingir o organismo do indivíduo. Ela afeta a respiração do animal, pode causar vômito, diarreia, convulsões, podendo levar o animal à óbito. O objetivo do presente trabalho foi padronizar um teste ELISA indireto com antígeno de superfície para o diagnostico cinomose utilizando amostras de soro canino. Para padronização da técnica, fez-se necessário o estudo da diluição do antígeno para identificar a melhor concentração para sensibilização da placa. O teste foi aplicado primeiramente com diferentes diluições do antígeno para detecção do melhor desempenho do antígeno. Feito isso, foi testado em um banco de soro de 45 animais comprovadamente positivos no teste ELISA comercial e em soro de 45 animais comprovadamente negativos no teste ELISA comercial, posteriormente foi calculado o ponto de corte, especificidade e sensibilidade do teste. O teste ELISA indireto se mostrou com excelência como um teste de diagnóstico para a cinomose canina, obtendo-se ponto de corte de densidade óptica de 0,229, sensibilidade de 95,5% e especificidade de 84,4%.

Distemper is a disease or the disease by the CDV virus, Distemper Virus. This disease mainly affects dogs, but also affects other domestic and wild species. The animal's immunity is related to the degree to which it will reach the individual's organism. It affects the animal's breathing, can cause vomiting, diarrhea, convulsions, and can lead to death. The aim of the present work test was to standardize an indirect ELISA for distemper diagnosis in experiments using a surface antigen. For the study of technical identification, it was necessary to specify the antigen for the best concentration of plaque sensitization. The test was initially applied with different dilutions of the antigen to detect the best performance of the antigen. This was tested in a serum bank of 45 animals proven positive in the commercial ELISA test and in the serum of 45 animals proven negative in the commercial ELISA test, later it was tested on the cut-off point, specificity and sensitivity of the test. The indirect ELISA test proved to be excellent as a diagnostic test for canine distemper, with an optical density cut-off of 0.229, sensitivity of 95.5% and specificity of 84.4% being obtained.

Sensitivity, specificity and comparison of three commercially available immunological tests in the diagnosis of Cryptosporidium species in animals

ABSTRACT The study was conducted to compare the specificity of immunological diagnostic methods used for the diagnosis of Cryptosporidium species capable of causing life-threatening infection in both immunosuppressed and immunocompetent patients. For the detection of Cryptosporidium species in 79 animals with diarrhoea, we used three Copro-antigen tests: RIDASCREEN® Cryptosporidium test, Cryptosporidium 2nd Generation (ELISA) and RIDA®QUICK Cryptosporidium. For immunoassays we used positive and negative samples detected by means of polymerase chain reaction and validated by sequencing and nested polymerase chain reaction to confirm the presence six different species of Cryptosporidium species. Prevalence of cryptosporidiosis in the entire group determined by enzyme immunoassay, enzyme linked immunosorbent assay, immuno-chromatographic test and polymerase chain reaction was 34.17%, 27.84%, 6.33% and 27.84%, respectively. Sensitivity of animal samples with enzyme immunoassay, enzyme linked immunosorbent assay, and immuno-chromatographic test was 63.6%, 40.9% and 22.7%, resp., when questionable samples were considered positive, whereas specificity of enzyme immunoassay, enzyme linked immunosorbent assay and immuno-chromatographic test was 75.9%, 78.9% and 100%, respectively. Positive predictive values and negative predictive values were different for all the tests. These differences results are controversial and therefore reliability and reproducibility of immunoassays as the only diagnostic method is questionable. The use of various Cryptosporidium species in diagnosis based on immunological testing and different results obtained by individual tests indicate potential differences in Copro-antigens produced by individual Cryptosporidium species.

Insertion of the LINE-1 element in the C-MYC gene and immunoreactivity of C-MYC, p53, p21 and p27 proteins in different morphological patterns of the canine TVT / Inserção do elemento LINE - 1 no gene C-MYC e imunorreatividade das proteinas C-MYC, p53, p21 e p27 nos diferentes padrões morfológicos do tumor TVT

The canine transmissible venereal tumor (TVT) affects the external genitalia of dogs by the natural transplant of viable tumor cells. Thus, this research aimed to diagnose and characterize TVT morphological patterns, identify the insertion of the LINE-1 element in C-MYC gene, by means of the polymerase chain reaction (PCR), and evaluate the immunohistochemical expression of C-MYC, p53, p21 and p27 proteins. The relationship between C-MYC and p53 proteins and their interference on the expression of p21 and p27 were also studied. For that, 20 samples of naturally occurring TVT were used, subjected to cytopathological, histopathological and immunohistochemical analysis, and to molecular diagnosis of neoplasia. The increased tissue expression and the correlation among C-MYC, p53, p21 and p27 proteins indicate reduction and/or loss of their functionality in the TVT microenvironment, with consequent apoptotic suppression, maintenance of cell growth and progression of neoplasia.(AU)

O tumor venéreo transmissível canino (TVT) afeta a genitália externa de cães pelo transplante natural de células tumorais viáveis. Assim, esta pesquisa teve como objetivo diagnosticar e caracterizar TVT em padrões morfológicos, identificar a inserção do elemento LINE-1 em gene C-MYC, por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR), e avaliar a expressão imuno-histoquímica do C-MYC, p53, p21 e p27. A relação entre C-MYC e as proteínas p53 e a sua interferência na expressão de p21 e p27 foram também estudadas. Para isso, foram utilizadas 20 amostras de ocorrência natural de TVT, submetido a exame citopatológico, histopatológica e imuno-histoquímica e ao diagnóstico molecular de neoplasia. A expressão aumentada do tecido e a correlação entre a C-MYC e as proteínas p53, p21 e p27 indicam redução e/ou perda de funcionalidade na TVT em seu microambiente, com consequente supressão apoptótica, manutenção do crescimento celular e progressão da neoplasia.(AU)

Desenvolvimento e padronização do Dot-ELISA usando peptídeos recombinantes para o diagnóstico sorológico de Neospora caninum / Development and standardization of Dot-ELISA using recombinant peptides for serological diagnosis of Neospora caninum

A neosporose é reconhecida como uma das maiores causas de aborto e perdas neonatais em bovinos de leite e corte em todo o mundo. Nos últimos anos esta doença tem atraído o interesse de pesquisadores com foco na epidemiologia e métodos eficazes de diagnóstico desta doença. No presente estudo objetivou-se desenvolver e padronizar um teste Dot-ELISA para o diagnóstico sorológico de Neospora caninum com um peptídeo recombinate como antígeno, visando o desenvolvimento de um kit para diagnóstico a campo. O peptídeo recombinante (rNcGRA1) foi desenhado com base na metodologia de genética reversa de epítopos antigênicos originados de uma proteína de grânulos densos de N. caninum, e sintetizado pela GenScript (USA). Produzido mediante o processo fermentativo em leveduras Pichia pastoris KM71. Para a padronização do Dot-ELISA, membranas de nitrocelulose de 0.22µm foram sensibilizadas com 1µL do antígeno e posteriormente os soros foram diluídos em solução de lavagem e incubados durante 1 hora. A revelação foi feita mediante a adição de Proteína G marcada com peroxidase por 30 minutos, seguido da solução reveladora a base de 3,3’-Diaminobenzidine (DAB). Logo após a padronização foram testados 44 soros bovinos diagnosticados por imunofluorescência indireta (RIFI), obtendo-se uma concordância nos resultados do teste de 95,5% e uma sensibilidade e especificidade de 100% e 92% respectivamente. Quanto ao Kit para diagnóstico a campo na Plataforma Tecnológica RapidFlow-Through Miriad®, o peptídeo rNcGRA1 apresentou marcações visíveis ao reagir com os soros positivos, e não apresentou marcações usando os soros negativos. Este estudo é o primeiro a utilizar peptídeos recombinantes e mostrar-se eficiente para o diagnóstico sorológico de bovinos naturalmente infetados por N. caninum...

Neosporosis is recognized as a major cause of abortion and neonatal loss in cattle worldwide, both for dairy cattle and beef cattle. In recent years this disease has attracted the interest of researchers and studying the epidemiology and effective methods of diagnosis of this disease. The present study aimed to develop and standardize on a Dot-ELISA for the serological diagnosis of Neospora caninum by using recombinant peptide as antigen for the development of a diagnostic kit used on the field. The recombinant antigen (rNcGRA1) was designed based on the method of reverse genetics derived antigenic epitopes of dense granules protein of N. caninum and synthesized by GenScript (USA). It was produced by the fermentation in yeasts Pichiapastoris KM71. The serological technique was used for the Dot-ELISA detection of IgG specific for N. caninum in which 0.22μm nitrocellulose membranes were sensitized with 1μL of antigen and subsequently the plasmas were diluted in a washing solution and incubated for 1 hour. The results will revealed by the addition of Protein G labeled with peroxidasse for 30 minutes, followed by the developing solution based on 3,3’-Diaminobenzidine (DAB). Soon after standardization tested 44 bovine plasmas were diagnosed by indirect immunofluorescence assay (IFA), agreeing with the results on a 95.5% and a sensitivity and specificity of 100% and 92% respectively. In regard to the diagnostic kit for the Technology Platform Rapid Flow-Through Miriad®, the peptide presented rNcGRA1 visible markings to react with positive plasma, and showed no markings using the negative plasma. This study is the first to use recombinant peptides and prove to be efficient for the serological diagnosis of cattle naturally infected...

Development and evaluation of a novel subunit vaccine for Mycoplasma gallisepticum / Desenvolvimento e avaliação de uma nova vacina para Mycoplasma gallisepticum

Adhesion proteins from Mycoplasma gallisepticum (MG) encoded by cytadhesion genes mgc1 and mgc2 were cloned into plasmid vectors and transformed into E. coli. Seventeen groups of specific-pathogen free (SPF), birds at four weeks of age were used to inoculate these two proteins (MGC1 and MGC2) mixed into an oil emulsion creating a novel MG vaccine. Six different protein concentrations (50, 100, 200, 400, 800, and 1000µg/bird) were tested with two equal concentration doses at four and seven weeks of age. In addition, many control groups were needed such as bacterin, membrane, no vaccine or challenge, oil emulsion alone, and no vaccine but challenged. Three weeks following the second vaccination, 50% of the birds in each treatment group were challenged with MG strain S6. The remaining birds were left as contacts to verify protection against horizontal transmission. All birds were bled before vaccinations, challenge and euthanasia. Birds were negative for MG at the first vaccination, as shown by serum plate agglutination test. At necropsy, tissue samples (trachea, lungs, and air sacs) were collected for histopathological examination. Swabs from trachea were used for PCR analysis. ELISA results showed a strong immune response to both protein preparations and almost the same response level for different doses tested, proving the immunogenic features of MGC1 and MGC2. However, humoral responses failed to prevent MG infection and disease when challenged as demonstrated by PCR and histopathology. MGC1 contact birds showed some degree of infection by PCR analysis. In addition, histopathological and ELISA results suggest that contact birds did not have enough time to develop lesions and to mount an immune response.

Os genes mgc1 e mgc2, codificadores de duas proteínas de adesão (MGC1 e MGC2) da bactéria Mycoplasma gallisepticum, foram clonados em E. coli. Dezessete grupos de aves livres de patógenos específicos (SPF), com quatro semanas de idade, foram inoculados com uma emulsão oleosa contendo as proteínas MGC1 e MGC2 purificadas. Seis concentrações (50, 100, 200, 400, 800, e 1000µg/ave) foram testadas com duas doses idênticas, às quatro e sete semanas de vida, respectivamente. Além disso, grupos controles foram avaliados com uma vacina comercial contra micoplasmose aviária, membrana de MG, grupo sem vacina/sem desafio, grupo vacina oleosa de MGC1 sem desafio, grupo com vacina oleosa de MGC2 sem desafio, grupo desafiado mas sem vacina. Três semanas após a segunda e a última vacinação, 50% dos animais dos grupos tratamentos foram desafiados com a cepa S6 de MG. O restante dos animais foi deixado como contato para averiguar proteção contra a transmissão horizontal da doença. Amostras de sangue de todas as aves foram coletadas antes das vacinações, do desafio e da eutanásia. As aves eram negativas para MG às quatro semanas de vida, conforme visto na aglutinação em placa. Na necropsia, tecidos (traqueia, pulmão e sacos aéreos) foram coletados para exame histopatológico. Suabes da traqueia foram utilizados para a PCR. Os resultados do ELISA demonstraram forte resposta imune contra as duas proteínas testadas e resposta similar independentemente do número de doses, provando a sua capacidade imunogênica. Porém, esta resposta humoral gerada foi incapaz de prevenir a infecção e a doença após desafio, conforme demonstrado pelos exames PCR e histopatológico. Aves-contato, inoculadas com MGC1, demonstraram estar infectadas nas análises de PCR. Além disso, os resultados do histopatológico e ELISA sugerem que os animais-contato não tiveram tempo suficiente para demonstrar lesões ou resposta imune.

Leishmaniose visceral canina no município de São Vicente Férrer,Estado de Pernambuco, Brasil / Canine visceral leishmaniasis at the urban area of the Municipality of

Iniciou-se um estudo sobre a ocorrência de leishmaniose visceral canina em cães do município de São Vicente Férrer noestado de Pernambuco. No período de julho de 2003 a julho de 2005, foram coletadas amostras de sangue de 503 cãesdomésticos, de diferentes localidades, escolhidos aleatoriamente, para exame pelo teste de imunofluorescência indireta (IFI).Foram processadas preliminarmente 503 amostras de soro, das quais 12,3% (62 amostras) estavam positivas para Leishmania.Quanto às titulações encontradas nos soros reagentes, 77,4% (48 amostras) tiveram títulos de 1:40; 9,6% (6 amostras), 1:80;8,0% (5 amostras), 1:160; 3,2% (2 amostras) e 1:320 e 1,6% (1 amostra) 1:640. A partir desse resultado foram selecionados20 dos cães sorologicamente positivos para realização do aspirado de medula óssea. Destes, 85% (17) apresentaramformas amastigotas de Leishmania sp. Este é o primeiro registro do encontro de cães sorologicamente positivos paraLeishmania no município de São Vicente Férrer, estado de Pernambuco, Brasil

A study was initiated on the occurrence of Visceral Canine leishmaniasis in dogs of the Municipality of São Vicente Férrer in thestate of Pernambuco. In the period of July of 2003 the July of 2005, blood samples of 503 domestic dogs were collected fromdifferent localities, randou by and they were examined by using immunoflorecens test (IFAT). A total of 503 samples of serumwere processed preliminarily of which 12.3% (62 samples) were positive for visceral leishmaniasis. Where 77.4% (48 samples)had headings of 1:40; 9.6% (6 samples) 1:80; 8.0% (5 samples) 1:160; 3.2% (2 samples) 1:320 and 1.6% (1 sample) 1:640.From this result 20 of the sorologicamente positive dogs for accomplishment of the inhaled one of borne marrow had beenselected. Of these, 85% (17) had presented forms amastigotas of Leishmania sp. This is the first register of the detention ofsorologicamente positive dogs for Leishmania at Municipality of São Vicente Férrer, in state of Pernambuco, Brazil

A importância do diagnóstico da cisticercose bovina / The importance of bovine cysticercosis diagnostic

A cisticercose bovina é uma enfermidade cosmopolita, que afeta principalmente as regiöes cuja populaçäo apresenta baixas condiçöes sócio-econômicas. No Brasil, a prevalência dessa zoonose, é obtida através de dados fornecidos pelos serviços de inspeçäo, em matadouros. Várias pesquisas indicam a baixa sensibilidade da inspeçäo "post-mortem", associando-se a isso a incapacidade dos métodos parasitológicos de demonstrarem a presença desse parasita nos bovinos; torna-se necessário o desenvolvimento de métodos de diagnóstico mais eficazes e seguros que possam ser realizados no animal antes do abate.

Validity of some immunological and thrombocytopenia tests for diagnosing early pregnancy in buffaloes

The present investigation was carried out to evaluate the validity and accurancy of some laboratory tests in diagnosing early pregnancy in buffaloes as a tool to reduce the breeding and calving intervals. Therefore, plasma progesterone concentration and thrombocyte counts were determined before and after natural service or insemination. Precipitation test, using foetal antibodies and cotyledons antibodies was performed in the plasma of the examined animals [3-5 weeks post-service or insemination]. Results of the present investigation revealed that no early pregnancy associated thrombocytopenia was detected in buffaloes which make this test invalid for detection of early pregnancy. Application of precipitation test using foetal antibodies, although still in a stage of developing, its accuracy was 78.43% in pregnant and 84.75% in non pregnant buffaloes. In addition, the accuracy of precipitation test using cotyledons antibodies was 74% in pregnant and 79.45% in non pregnant buffaloes. Thuse, it can be concluded that the precipitation test using foetal or cotyedons antibodies is simple, paratical, useful and can be used under field conditions

Estudo clínico da infecção de felinos pelo vírus da leucemia felina em São Paulo / Clinical studies of feline leukemia virus infection among cats in São Paulo

Para avaliar a freqüência da infecção pelo vírus da leucemia felina (VLF), 298 gatos doentes, atendidos no Hospital Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, foram submetidos ao teste imunoenzimático para a detecção de antígenos virais do VLF (Leukassay F., Pitman Moore Inc.). Dos animais submetidos ao teste, 37 (12,5%) apresentaram-se positivos, com diagnóstico clínico de hemobartonelose (10), linfoma mediastinal (7), icterícia e febre (3), peritonite infecciosa felina (2), anemia hipoplásica (2), uveíte (2), gastroenterite (2), trombocitopenia (2), periodontite (2) atrofia do timo (1), doença respiratória crônica (1) e contactante e assintomático (1). A maioria dos animais acometidos situava-se na faixa etária de 30 a 36 meses, tendo o mais jovem um mês e o mais velho 12 anos de idade. A infecção foi observada com maior freqüência entre os machos, que responderam por 67,5% dos casos, havendo também predominância dos felinos sem raça definida.

Serum samples from 298 sick cats were submitted to enzyme linked immunosorbent assay for detecting feline leukemia virus (Felv) antigen (Leukassay F., Pitman Moore), aiming to evaluate the frequence of Felv infection among domestic cats. Thirty seven Felv (12.5%) positiva cats were found. The reagents were observed among cats with clinical diagnosis of hemobartonellosis (10), mediastinal lymphoma (7), jaundice and fever (3), feline infectious peritonitis (2), hypoplastic anemia (2), uveitides (2), gastroenteritidis (2), trombocytopenia (1), periodontitides (2), atrophy of thymus (1), chronic respiratory disease (1), carcinoma (1), and asymptomatic (1). The great majority of cats were 30 to 36 months old, being the youngest one month old and the oldest one, twelve years. Felv infection was more frequent among male cats (67.5%) and in short haired domestic cats.