Phosphorylation of 46-kappa Da protein of synaptic vesicle membranes is stimulated by GTP and Ca2+/calmodulin

The release of neurotransmitter is regulated in the processes of membrane docking and membrane fusion between synaptic vesicles and presynaptic plasma membranes. Synaptic vesicles contain a diverse set of proteins that participate in these processes. Small GTP-binding proteins exist in the synaptic vesicles and are suggested to play roles for the regulation of neurotransmitter release. We have examined a possible role of GTP-binding proteins in the regulation of protein phosphorylation in the synaptic vesicles. GTPgammaS stimulated the phosphorylation of 46 kappa Da protein (p46) with pI value of 5.0-5.2, but GDPbetaS did not. The p46 was identified as protein interacting with C-kinase 1 (PICK-1) by MALDI-TOF mass spectroscopy analysis, and anti-PICK-1 antibody recognized the p46 spot on 2-dimensional gel electrophoresis. Rab guanine nucleotide dissociation inhibitor (RabGDI), which dissociates Rab proteins from SVs, did not affect phosphorylation of p46. Ca2+/ calmodulin (CaM), which causes the small GTP- binding proteins like Rab3A and RalA to dissociate from the membranes and stimulates CaM- dependnet protein kinase(s) and phosphatase, strongly stimulate the phosphorylation of p46 in the presence of cyclosporin A and cyclophylin. However, RhoGDI, which dissociates Rho proteins from membranes, reduced the phosphorylation of p46 to the extent of about 50%. These results support that p46 was PICK-1, and its phosphorylation was stimulated by GTP and Ca2+/CaM directly or indirectly through GTP-binding protein(s) and Ca2+/CaM effector protein(s). The phosphorylation of p46 (PICK-1) by GTP and Ca2+/CaM may be important for the regulation of transporters and neurosecretion.

The release of catecholamines by an endogenous factor that inhibits neuronal Na+, K(+)-ATPase

Se ha demostrado que la inhibición de la Na+, K+-ATPasa produce liberación de neurotransmisor en distintos modelos experimentales. En este laboratorio se observó previamente que una fracción soluble separada mediante Sephadex G-50 (pico II) es capaz de inhibir la actividad de Na+, K+-ATPasa pero no de otras enzimas asociadas a membranas. El objetivo del presente trabajo fue probar el efecto de la fracción pico II de cerebro sobre el contenido de neurotransmisor de las vesículas sinápticas de los nervios pineales. Se usaron ratas no inyectadas y ratas inyectadas 30 min antes con 5-hidroxidopamina (30 mg per Kg, i.p.). La 5-hidroxidopamina produce un falso neurotransmisor cuya presencia en las vesículas sinápticas se visualiza luego de la fijación con glutaraldehído-osmio como un material electrón denso que llena total o parcialmente las vesículas. En ratas no inyectadas se estudió la osmiofilia y la reacción cromafín del nucleoide electron denso. Las glándulas pineales se incubaron en solución Tyrode sin calcio en presencia y ausencia de pico II a temperatura ambiente y se estudiaron al microscopio electrónico. Cuando las glándulas de las ratas pretratadas con 5-hidroxidopamina se incubaron con pico II se observó una disminución siginificativa en el número de vesículas totalmente llenas de material electrón denso. Esto indica una reducción en el contenido de falso neurotransmisor contenido en la matriz de las vesículas sinápticas. Este efecto sobre las vesículas sinápticas no se observó en presencia de pico II invejecido, que no inhibe la Na+, K+-ATPasa. Cuando las gládulas de ratas no inyectadas se incubaron con pico II no se observaron cambios ni en la osmiofilia ni en la reacción cromafin de las vesículas sinápticas. La osmiofilia y la reacción cromafin del nucleoide electrón denso marca el sitio de acumulación de monoaminas (catecol e indolaminas en los nervios pineales). Estos resultados son coherentes con la idea de una relación entre la inhibición de la actividad de Na+, K+-ATPasa y la liberación de una fracción de neurotransmisor acumulado en los terminales nerviosos