Proteínas mir-203a-3p e mmp-2 são altamente expressas em células tumorais circulantes de pacientes com carcinoma pancreático / Mir-203a-3p and mmp-2 proteins are highly expressed in circulating tumor cells from patients with pancreatic carcinoma

RESUMO -RACIONAL: O adenocarcinoma ductal do pâncreas é a quarta causa de morte associada ao câncer mais comum no mundo ocidental. A presença de células tumorais circulantes (CTCs) pode ser considerada um potencial fator prognóstico, visto que essas células representam a progressão tumoral, permitindo o monitoramento da eficácia terapêutica. OBJETIVOS: explorar as características morfológicas, moleculares e fenotípicas das células tumorais circulantes (CTCs) do sangue de pacientes com carcinoma pancreático e correlacionar os achados com a resposta ao tratamento, sobrevida livre de progressão, sobrevida global (SG) e trombose venosa profunda (TVP). MÉTODOS: o sangue periférico (10mL) foi analisado antes do início do tratamento e após 60 e 120 dias. As CTCs foram detectadas pelo ISET® e caracterizadas por imunocitoquímica. Para análise de miRNAs, leucócitos periféricos dos mesmos pacientes e indivíduos saudáveis foram coletados em paralelo no início do estudo. A expressão de miRNAs foi avaliada usando TaqMan T Array Human MicroRNA Cards v2.0. RESULTADOS: foram incluídos 9 pacientes. As proteínas MMP2 e TGFß-RI foram altamente expressas (77,7%) nas CTCs no início do estudo. No primeiro acompanhamento, MMP2 era predominante (80%) e no segundo acompanhamento, MMP2 e vimentina eram predominantes (50%). Microêmbolos tumorais circulantes (MTC) foram encontrados em dois pacientes e ambos apresentavam TVP. O miR-203a-3p foi altamente expresso em CTCs. miR-203a-3p está envolvido na estimulação da transição epitelio-mesenquima (TEM) e relacionado a pior SG no câncer pancreático (dados TCGA). CONCLUSÃO: Devido ao baixo número de pacientes e curto seguimento, não observamos correlação entre CTCs e resposta ao tratamento. No entanto, houve uma correlação entre MTC e TVP. Além disso, miR-203a-3p foi altamente expresso em CTCs, corroborando os achados de proteínas EMT. Este estudo abre perspectivas sobre a mudança dinâmica no padrão de proteínas expressas ao longo do tratamento e a utilização de miRNAs como novos alvos no carcinoma pancreático.

ABSTRACT - BACKGROUND: Ductal adenocarcinoma of the pancreas is the fourth most common cancer-associated cause of death in the Western world. The presence of circulating tumor cells (CTCs) can be considered a potential prognostic factor, as these cells represent tumor progression, allowing monitoring of therapeutic efficacy. OBJECTIVES: The objectives of this study were to explore the morphological, molecular, and phenotypic characteristics of CTCs from the blood of patients with pancreatic carcinoma and to correlate the findings with response to treatment, progression-free survival, overall survival (OS), and deep vein thrombosis (DVT). METHODS: Peripheral blood (10 mL) was analyzed before the beginning of treatment after 60 and 120 days. CTCs were detected by using ISET® and characterized by immunocytochemistry. For microRNAs (miRNAs) analysis, peripheral leukocytes from the same patients and healthy individuals (controls) were collected in parallel at baseline. The expression of miRNAs was evaluated (in pool) using TaqMan® Array Human MicroRNA Cards v2.0. RESULTS: Only nine patients were included. The proteins, namely, matrix metalloproteinase-2 (MMP2) and TGFβ-RI, were highly expressed (77.7%) in CTCs at baseline; at the first follow-up, MMP2 was predominant (80%) and, at the second follow-up, MMP2 and vimentin were predominant (50%). Circulating tumor microemboli (CTMs) were found in two patients and both presented DVT. The miR-203a-3p was highly expressed in CTCs. The miR-203a-3p is involved in the stimulation of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and is related to worse OS in pancreatic cancer (TCGA data). CONCLUSION: Due to the low number of patients and short follow-up, we did not observe a correlation between CTCs and response to treatment. However, there was a correlation between CTM and DVT and also miR-203a-3p was highly expressed in CTCs, corroborating the findings of EMT proteins. This study opens the perspectives concerning the dynamic change in the pattern of proteins expressed along with treatment and the use of miRNAs as new targets in pancreatic carcinoma.

Evaluating mmp-2 and tgfß-ri expression in circulating tumor cells of pancreatic cancer patients and their correlation with clinical evolution / Avaliação da expressão de mmp-2 e tgfß-ri em células tumorais circulantes de pacientes com câncer de pâncreas e sua correlação com evolução clínica

ABSTRACT Background: Metastasis is common in the diagnosis of pancreatic cancer, and the presence of epithelial-mesenchymal transition markers in circulating tumor cells may suggest worse prognosis. Aim: To correlate the number of circulating tumor cells (CTCs) in the peripheral blood of patients with a locally advanced or metastatic pancreatic tumor and the protein expression involved in epithelial-mesenchymal transition (EMT) in CTCs with clinical characteristics, progression-free survival (PFS) and overall survival (OS). Method: This was a prospective study conducted using peripheral blood samples collected at three different times. CTCs were quantified by the ISET test and analyzed by immunocytochemistry. Proteins involved in EMT (vimentin, TGFß-RI and MMP2) were analyzed in all CTCs. Results: Twenty-one patients were included. Median CTCs detected were 22, 20 and 8 CTCs/8 ml blood at baseline, first and second follow-up, respectively. No statistically significant correlation was found in correlating the number of CTCs and the evaluated clinical characteristics, PFS, or OS. There was no difference in PFS and OS among the EMT markers in the groups with and without markers. Conclusion: CTC analysis was not relevant in this sample for comparing clinical findings, PFS and OS in patients with pancreatic cancer. However, marker analysis in CTCs could be useful for the MMP-2 and/or TGFß-RI expression, as observed by the separate PFS curve.

RESUMO Racional: A metástase é comum no diagnóstico de câncer de pâncreas; presença de marcadores de transição epitélio-mesenquimal nas células tumorais circulantes (CTCs) podem sugerir pior prognóstico. Objetivo: Correlacionar o número de CTCs no sangue periférico de pacientes com tumor de pâncreas localmente avançado ou metastático e expressão de proteínas envolvidas na transição epitélio-mesenquimal (TEM) nas CTCs com características clínicas, sobrevida livre de progressão (SLP) e global (SG). Método: Estudo prospectivo realizado por meio de coletas de sangue periférico em três tempos distintos. As CTCs foram quantificadas pelo sistema ISET e analisadas por imunocitoquímica. Proteínas envolvidas na TEM (vimentina, TGFß-RI e MMP2) foram analisadas em todas as CTCs. Resultados: Foram incluídos 21 pacientes. A mediana de CTCs detectadas foi de 22, 20 e 8 CTCs/8 ml de sangue no baseline, primeiro e segundo seguimentos, respectivamente. Na correlação entre número de CTCs e as características clínicas levantadas, SLP, SG não houve correlação estatisticamente significante. Nos marcadores de TEM não houve diferença de SLP e SG entre os grupos que apresentaram e não apresentaram marcação. Conclusão: As CTCs não se mostraram relevantes na comparação dos achados clínicos, SLP e SG em pacientes com câncer de pâncreas. No entretanto, pode ser que para a análise de marcador seja útil, como observado pelas curvas separadas de expressão de MMP-2 e TGFß-RI nas CTCs.

Identificação de células tumorais circulantes e outros componentes sanguíneos em pacientes com câncer de cólon localizado / Identification of circulating tumor cells and other blood componentes in localized colon cancer

Introdução: A detecção precoce do câncer de cólon proporciona altas taxas de cura, no entanto, há pacientes que apresentam recidiva local e metástase à distância. As células tumorais circulantes (CTCs) e os microêmbolos circulantes (MEs) desempenham um papel importante nestes processos. Objetivo: avaliar o papel de CTCs e MEs em pacientes com câncer de cólon localizado. Material e métodos: foram coletados 10 mL de sangue de pacientes com câncer de cólon pré-cirúrgico, pré-adjuvância e 6 meses após o final do tratamento. As amostras foram processadas no dispositivo ISET® e as CTCs foram fixadas com formaldeído e identificadas por imunocitoquímica. Para detecção de expressão de RNAm, foi realizada a técnica de hibridização in situ cromogênica. O DNA foi extraído das membranas sem formaldeído e analisado por PCR digital em gotas. Resultados: no módulo I, foram incluídos 69 pacientes (18 com estágio I, 15 com estágio II e 36 com estágio III). A taxa de detecção de CTCs na primeira coleta foi de 94,2%, de 94,6% no primeiro seguimento e de 100% no segundo seguimento. Foi observada uma queda global na mediana de CTCs ao longo do tempo. No segundo seguimento, a expressão de ERCC1 e de ß-galactosidase nas CTCs foi mais encontrada em pacientes com estágio III (p= 0,03 e p= 0,04, respectivamente). A expressão de ERCC1 com alto índice de positividade (IP) nas CTCs, no segundo seguimento foi determinante de sobrevida livre de recidiva (SLR) inferior (p= 0,014). Foi encontrada uma correlação positiva entre o nível de CTCs e a porcentagem de células TReg (p= 0,01) e negativa entre o nível de CTCs e a porcentagem de linfócitos CD3+ (p= 0,01). Pacientes com alta Platelet-to-Lymphocyte Ratio (PLR) encontravam-se em sua maioria com estadiamentos patológicos II de alto risco e III (p= 0,014). Alta PLR foi determinante de SLR inferior (p= 0,01). No módulo II (pacientes com tumores de alto risco, submetidos à quimioterapia adjuvante) foi encontrada uma correlação positiva entre os níveis de CTC e CEA nos casos que tiveram recidiva da doença (p= 0,001). Alto IP de ERCC1 no segundo seguimento foi determinante de SLR significantemente inferior (p= 0,013). Conclusões: CTCs foram encontradas em altas taxas nos pacientes com câncer de cólon localmente avançado. A avaliação do sistema imunológico dos pacientes juntamente com as CTCs demonstrou ser uma ferramenta promissora para acompanhamento destes pacientes

Introduction: The early detection of colon cancer provides high cure rates, however, there are patients that present local relapse and distant metastasis. Circulating tumor cells (CTCs) and circulating tumor microemboli (CTM) play a crucial role in these processes. Objectives: to evaluate the role of CTCs and CTM in non-metastatic colon cancer patients. Material and methods: 10 mL of blood were collected from colon cancer patients prior to the surgery, prior to the adjuvant treatment, and 6 months after the treatment end. Samples were processed in the ISET® device and CTCs were formaldehyde-fixed and identified by immunocytochemistry. For mRNA expression in situ hybridization was applied. The DNA was extracted from the non-fixed CTCs and analyzed by droplet digital PCR. Results: there were 69 patients included (18 at stage I, 15 at stage II, and 36 at stage III) at module I. The CTC detection rate at baseline was 94.2%, at first follow-up was 94.6%, and at second follow-up was 100%. It was observed an overall drop in CTC median over time. At second follow-up, ERCC1 and ß-galactosidase expression in CTCs was most commonly found in stage III patients (p= 0.03 and p= 0.04, respectively). High positivity index (PI) of ERCC1 in CTC at second follow-up was determinant of inferior relapse-free survival (RFS) (p= 0.014). It was found a positive correlation between CTC levels and the percentage of TReg cells (p= 0.01) and a negative correlation between CTC levels and the percentage of CD3+ lymphocytes. Patients with high Platelet-to-Lymphocyte Ratio (PLR) were mostly found in high-risk stage II and III patients (p= 0.014). High PLR was determinant of inferior RFS (p= 0.01). At module II (patients with high-risk tumors, treated with adjuvant chemotherapy), it was found a positive correlation between CTC and CEA levels in the cases that shown disease progression (DP) (p= 0.001). High PI of ERCC1 at second follow-up had shown significantly worse RFS (p= 0.013). Conclusions: CTCs were found in high rates in localized colon cancer patients. Additionally, the evaluation of the patient's immune combined with the CTCs showed to be a promising tool to monitoring these patients