Sensibilidad in vitro a benznidazol, nifurtimox y posaconazol de cepas de Trypanosoma cruzi de Paraguay / In vitro susceptibility to benznidazole, nifurtimox and posaconazole of Trypanosoma cruzi isolates from Paraguay

Resumen: Introducción. Trypanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas, exhibe una sustancial heterogeneidad fenotípica y genotípica que puede influir en las variaciones epidemiológicas y clínicas de la enfermedad, así como en la sensibilidad a los fármacos utilizados en el tratamiento. Objetivo. Evaluar la sensibilidad in vitro al benznidazol, el nifurtimox y el posaconazol de 40 cepas clonadas de T. cruzi de Paraguay, con distintos genotipos, huéspedes y localidades de origen. Materiales y métodos. En su estado epimastigote, los parásitos se incubaron en medio de cultivo LIT (Liver Infusion Tryptose) con diferentes concentraciones de cada fármaco en ensayos por triplicado. El grado de sensibilidad se estimó a partir de las concentraciones inhibitorias del 50 y el 90% (IC50 e IC90) y se obtuvieron los valores promedio y la desviación estándar de cada cepa y fármaco. La significación estadística entre grupos se determinó mediante análisis de varianzas con el test no paramétrico de Wilcoxon/Kruskal-Wallis y valores de p<0,05. Resultados. Se observó un amplio rango de respuesta a los fármacos. Se identificaron dos grupos de parásitos (A y B) con diferencias significativas en la sensibilidad al benznidazol (p<0,0001), y tres grupos (A, B, C) en cuanto a la sensibilidad al nifurtimox y el posaconazol (p<0,0001). Conclusiones. En general, las cepas fueron más sensibles al nifurtimox que al benznidazol y el posaconazol. Estas diferencias evidencian la heterogeneidad de las poblaciones de T. cruzi que circulan en Paraguay, lo que debe considerarse en el tratamiento y el seguimiento de las personas afectadas.

Abstract: Introduction: Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease, shows substantial phenotypic and genotypic heterogeneity, which can influence the epidemiological and clinical variations of the disease and the sensitivity to the drugs used in the treatment. Objective: To assess the in vitro susceptibility to benznidazole, nifurtimox, and posaconazole of 40 cloned strains of T. cruzi isolated in Paraguay belonging to different genotypes, hosts, and localities. Materials and methods: We incubated the parasites in their epimastigote stage in LIT culture medium with different concentrations of each drug in triplicate assays. The degree of susceptibility was estimated by the inhibitory concentrations of 50 and 90% (IC50 and IC90) to obtain the average values and the standard deviation for each strain and drug. We determined the statistical significance between groups by analysis of variances with the Wilcoxon/Kruskal-Wallis non-parametric test and values of p<0.05. Results: A wide range of drug response was observed. Two groups of parasites (A and B) were identified as having significant differences in susceptibility to benznidazole (p<0.0001), and three groups (A, B, C) to nifurtimox and posaconazole (p<0.0001). Conclusions: Overall, the isolates were more susceptible to nifurtimox than benznidazole and posaconazole. Such differences highlight the heterogeneity of T. cruzi populations circulating in Paraguay, an aspect to consider in the treatment and follow up of patients.

First report of Sapajus cay naturally infected by Trypanosoma cruzi in San Pedro Department, Paraguay / Primeiro relato de infecção natural em Sapajus cay por Trypanosoma cruzi em Departamento San Pedro, Paraguai

Abstract To verify the occurrence of natural Trypanosoma cruzi infection in non-human primates from a rural endemic area of the east region of Paraguay, xenodiagnosis was performed in 35 animals belonging to two species. For genotyping and T. cruzi discrete typing unit (DTU) assignment, a combination of four markers was used, including amplification products of the small (18S) and large (24Sα) subunits of ribosomal ribonucleic acid gene, the intergenic region of mini-exon gene and the heat shock protein 60 Eco-RV polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (HSP60/EcoRV-PCR-RFLP). One specimen of Sapajus cay was found positive and infected by the DTU TcII. This result constitutes the first record of natural T. cruzi infection in a sylvatic monkey in Paraguay, harbouring a DTU associated with severe Chagas disease in humans.

Resumo Com o objetivo de verificar a infecção natural por Trypanosoma cruzi em primatas não-humanos de uma área endêmica rural da região leste do Paraguai, foi realizado o xenodiagnóstico em 35 animais pertencentes a duas espécies. Para a genotipagem foi utilizada a unidade discreta de tipagem (UDT) do T. cruzi, em uma combinação de quatro marcadores, incluindo amplificação de produtos de pequena (18S) e grande (24Sα) subunidades do gene do ácido ribonucleico ribossômico, da região intergênica de miniéxon e do gene da proteína de choque térmico 60 (HSP60/EcoRV-PCR-RFLP), pela reação em cadeia da Polimerase. Um espécime de Sapajus cay se mostrou positivo pelo UDT TcII. Este resultado constitui o primeiro relato da infecção natural pelo T. cruzi em um macaco silvestre no Paraguai, abrigando um UDT associado com a doença de Chagas grave em humanos.

Reservorios mamíferos del Trypanosoma cruzi en Paraguay / Mammalian reservoirs of Trypanosoma cruzi in Paraguay

La transmisión enzoótica del Trypanosoma cruzi en Paraguay aún no ha sido bien determinada. Por lo tanto, todavía se desconocen varios aspectos de la dinámica de transmisión de este parásito en el medio selvático, como ser especies de reservorios naturalmente infectados, cepas circulantes y el grado de interacción con el ciclo doméstico. Con los estudios realizados hasta la fecha, se han identificado cinco especies como reservorios naturales del T. cruzi: Didelphis azarae, Monodelphis domestica, Dasypus novemcinctus, Euphractus sexcinctus y Chaetophractus spp. en el ambiente silvestre de zonas endémicas para la enfermedad de Chagas (Chaco y San Pedro). Entre éstas se destaca la especie Dasypus novemcinctus, en la cual se ha observado una alta prevalencia de infección de alrededor del 50%. En el ambiente doméstico, se han reportado perros infectados con este parásito en mayor proporción y en menor grado gatos, reses y cerdos.

Cepas de Trypanosoma cruzi en el Paraguay / Trypanosoma cruzi strains in Paraguay

Las poblaciones del Trypanosoma cruzi que circulan en Paraguay han mostrado una gran diversidad genética, la cual ha sido evaluada usando diferentes metodologías y técnicas. Se han identificado varios genotipos de este parásito infectando una diversidad de hospederos, incluyendo pacientes, vinchucas, animales silvestres y domésticos de diferentes regiones. La diversidad genética observada en los aislados de nuestro país podría implicar diferencias en las manifestaciones clínicas de la enfermedad de Chagas, así como diferencias en sus características biológicas, como ser el grado de infectividad, virulencia, patogenicidad, capacidad antigénica y susceptibilidad o resistencia a las drogas tripanocidas. Hasta el momento, estos aspectos han sido poco explorados y evaluados en las cepas paraguayas. El aislamiento e identificación del grupo y subgrupos de T. cruzi, que circulan en los diferentes ciclos de transmisión en una determinada región geográfica, siguen siendo relevantes porque permiten conocer la dinámica de transmisión del parásito y evaluar el riesgo de introducción a partir de focos selváticos.

Isoenzyme profiles of Trypanosoma cruzi stocks from different areas of Paraguay

Twenty one Trypanosoma cruzi stocks from humans, domiciliary triatomines and one sylvatic animal of different areas of Paraguay were subjected to isoenzyme analysis. Thirteen enzyme systems (15 loci in total) were studied. MN cl2 (clonets 39) and SO34 cl4 (clonets 20) were used as references. Relationships between stocks were depicted by an UPGMA dendrogram constructed using the JaccardÝs distances matrix. Among the Paraguayan stocks 14 zymodemes were identified (Par1 to Par14), Par 5 being the most frequent. Polymorphism rate and clonal diversity were 0.73 and 0.93, respectively. Average number of alleles per polymorphic locus was 2.5 (range 2-4). These measurements show a high diversity, which is confirmed by the dendrogram topology. All stocks belong to the same lineage, as MN cl2 reference strain (T. cruzi II). Moreover three distinct subgroups were identified and two of them correspond to Brazilian and Bolivian zymodemes, respectively. The third subgroup, the most common in Paraguay, is related to Tulahuen stock. The large geographical distribution of some zymodemes agrees with the hypothesis of clonality for T. cruzi populations. However sample size was not adequate to detect genetic recombination in any single locality

Producción de anticuerpos policlonales / Policlonal antibody production / Annual reports 1998

El interés actual por técnicas inmunológicas para evaluación serológica en humanos con fines diagnòsticos, y el costo elevado de los reactivos de procedencias extrajera nos ha motivado a comunicar el proceso empleado en la producción de anticuerpos policlonales en el Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud. Para lo cual desarrollamos la obtención de anticuerpos anti-IgG humano, anti-Trypanosoma cruzi y antiToxoplasma gondii, por inmunización en cabras y purificación por cromatografía de intercambio iónico en Dietilaminoetil Celulosa. Se considera como esquema óptimo de inmunización un periodo de seis meses, con refuerzos periódicos mensuales y uno final de mayor concentración de inmunógeno, previo al sangrado total de las cabras. Esto se recomienda comparando los resultados obtenidos con los esquemas de inmunización 4 y 6 meses realizados en el presente trabajo. Se obtuvieron inmunoglobulinas especificas con este protocolo, de manera a utilizarlos con distintos propósitos como son la producción de reactivos de Inmunoenzimáticos para T. cruzi y T. gondii, así como también en preparación de inmunoconjugados para usos en inmunofluorescencia. Esto nos llevó a desarrollar técnicas que en esta primera etapa nos servirá para aumentar y mantener la producción de reactivos del IICS. Al mismo tiempo elaborar nuevos anticuerpos que serán utilizados en el desarrollo de métodos de captura de IgM para detección de T. cruzi y T. gondii en fase aguda

Evaluación de la técnica de hemocultivo y epidemiología de la enfermedad de Chagas en pacientes agudos y crónicos / Annual reports 1998 / Evaluation of the hemoculture technique and epidemiological characteristic of acute and chronic Chagas disease patients

El diagnóstico de la enfermedad de Chagas por métodos parasitológicos se realiza mediante la visualización directa o indirecta del parásito. La detección del mismo es relativamente fácil en la fase aguda, cuando la parasistemia es alta; sin embargo, durante las fases intermedias y la cronica se debe recurrir a métodos que requieren una observación más prologada como el xenodiagnóstico y el hemocultivo, siendo la sensibilidad de estos últimos menor. En este trabajo se determino la sensibilidad del hemocultivo en paciente chagasicos y se provee informaciones complementaria sobre las carácteristicas epidemiólogicas de los mismos. Se realizó un levantamiento retrospectivos de datos obtenidos de fichas de 100 pacientes chagasicos que consultaron en el Departamento de Medicina Tropical del IICS durante el periodo de enero 1984 a enero 1992. A todos estos pacientes se le realizo la prueba de hemocultivo en forma de rutina. El 21 por ciento de estos pacientes presentaron resultados positivos para T.cruzi por la tecnica de hemocultivo. Teniendo en cuenta el cuadro clinico de los pacientes, se observo que el 100 por ciento (4/4) de los casos agudos, el 73,2 por ciento (6/25) de los pacientes con lesiones cardiacas o digestivas y el 16,4 por ciento (11/67) de los individuos en la etapa indeterminada fueron positivos a la T.cruzi y el resto de los pacientes sin diagnostico clinico fue negativo por esta técnica. Teniendo en cuenta la edad de estos pacientes se encontro que los menores de 30 años dieron hemocultivo positivo más frecuentemente que aquellos que pertenecieron a grupos de mayor edad. En este estudio, la psibilidad del hemocultivo mostro cierta asociación con la edad y la procedencia del paciente chagasico

Caracterizacion Isoenzimatica de cepas de Trypanosoma Cruzi / Isoenzyme characterization of Trypanosoma Cruzi Strains / Annual Reports 1997

En este trabajo, 21 cepas de T. Cruzi aisladas de humanos , triatominos y mamíferos de losd Dptos de Pte. Hayes, Paraguarí, San Pedro, Caaguazú y Central, fueron sometidos al análisis isoenzimático. Se estudiaro 13 sistemas enzimáticos (15 loci en total) y como cepas de referencia se emplearon las cepas MN y SO34. Se encontraron 14 zimodemas (Z) diferentes, coincidieron con estdios previos de caracterización de cepas paraguayas de T. cruzi. No hubo asociación directa entre el tipo de zimodema y la procedencia. El caracter ubicuo mostrado por los zimodemas Z1 y Z5 en este estudio, apoya el criterio de clonalidad mencionado por otros autores

Tratamiento con benznidazol en niños de seis a doce años infectados con T. cruzi / Annual reports 1995 / Treatment with benznidazole in six-twelve aged children infected with T. cruzi

Este estudio se realizò en el marco del Programa Nacional de Control de la Enfermedad de Chagas se desarrollò a fin de evaluar el èxito terapèutico del benznidazol en niños de 6 a 12 años de edad infectados con T. cruzi y establecer las mejores tècnicas para determinar la cura parasitològica y serològica de las personas tratadas. Para ello, 20 niños en edad escolar procedentes de dos compañias del Departamento de Paraguarì (àrea endèmica para la enfermedad de Chagas), cuya infecciòn con T. cruzi fue determinada mediante un tamizaje serològico (ELISA), fueron tratados con benznidazol (5-7mg/kg de peso por 60 dìas). Antes del inicio del tratamiento, los niños fueron sometidos a un examen clìnico de control, hemocultivo, xenodiagnòstico, parasitemia directa, reacciòn en cadena de la polimerasa (PCR) y confirmaciòn serològica (ELISA, IFI). Ademàs, se realizaron determinaciones basales y a los 20 dìas del tratamiento de hemograma, GOT, bilirrubina total, directa e indirecta para controlar la apariciòn de efectos colaterales del tratamiento. No se observaron variaciones entre las determinaciones hematològicas y quìmicas basales y las realizadas a los 20 dìas. En el estudio basal, el 15 por ciento (3/20) de las muestras tuvo parasitemia directa positiva, el 5 por ciento (1/20) tuvo hemocultivo positivo, el 55 por ciento (11/20) de los xenodiagnòsticos fue positivo y el 85 por ciento (17/20) tuvo PCR positivo. En cuanto a la serologìa, el 100 por ciento de las muestras fueron positivas tanto por ELISA como por IFI. A los seis meses de finalizado el tratamiento, se realizò la primera evaluaciòn serològica y parasitològica detectàndose en el 100 por ciento de las muestras parasitemia negativa. La serologìa para T. cruzi siguiò siendo positiva en todos los casos por ambos mètodos (ELISA e IFI) pero se observò una disminuciòn de los tìtulos que fue estadìsticamente significativa tanto por ELISA (p<0,0001) como por IFI (p<0,05). A los seis meses del tratamiento, si bien todas las muestras fueron negativas por todos los mètodos parasitològicos incluyendo al PCR, tècnica altamente sensible en la fase crònica de la enfermedad de Chagas y al xenodiagnòstico, no se puede hablar aùn de cura en forma concluyente debido a la positividad de los mètodos serològicos que puede indicar presencia del paràsito o una memoria inmunològica remanente. Sin embargo, se debe resaltar la disminuciòn, estadìsticamente significativa, de los tìtulos serològicos por los dos mètodos utilizados

Tratameinto con benznidazol en niños de seis a doce años infectados con T. cruzi / Annual reports 1995 / Treatment with benznidazole in six-twelve aged children infected with T. cruzi

Este estudio se realizò en el marco del Programa Nacional de Control de la Enfermedad de Chagas se desarrollò a fin de evaluar el èxito terapèutico del benznidazol en niños de 6 a 12 años de edad infectados con T. cruzi y establecer las mejores tècnicas para determinar la cura parasitològica y serològica de las personas tratadas. Para ello, 20 niños en edad escolar procedentes de dos compañias del Departamento de Paraguarì (àrea endèmica para la enfermedad de Chagas), cuya infecciòn con T. cruzi fue determinada mediante un tamizaje serològico (ELISA), fueron tratados con benznidazol (5-7mg/kg de peso por 60 dìas). Antes del inicio del tratamiento, los niños fueron sometidos a un examen clìnico de control, hemocultivo, xenodiagnòstico, parasitemia directa, reacciòn en cadena de la polimerasa (PCR) y confirmaciòn serològica (ELISA, IFI). Ademàs, se realizaron determinaciones basales y a los 20 dìas del tratamiento de hemograma, GOT, bilirrubina total, directa e indirecta para controlar la apariciòn de efectos colaterales del tratamiento. No se observaron variaciones entre las determinaciones hematològicas y quìmicas basales y las realizadas a los 20 dìas. En el estudio basal, el 15 por ciento (3/20) de las muestras tuvo parasitemia directa positiva, el 5 por ciento (1/20) tuvo hemocultivo positivo, el 55 por ciento (11/20) de los xenodiagnòsticos fue positivo y el 85 por ciento (17/20) tuvo PCR positivo. En cuanto a la serologìa, el 100 por ciento de las muestras fueron positivas tanto por ELISA como por IFI. A los seis meses de finalizado el tratamiento, se realizò la primera evaluaciòn serològica y parasitològica detectàndose en el 100 por ciento de las muestras parasitemia negativa. La serologìa para T. cruzi siguiò siendo positiva en todos los casos por ambos mètodos (ELISA e IFI) pero se observò una disminuciòn de los tìtulos que fue estadìsticamente significativa tanto por ELISA (p<0,0001) como por IFI (p<0,05). A los seis meses del tratamiento, si bien todas las muestras fueron negativas por todos los mètodos parasitològicos incluyendo al PCR, tècnica altamente sensible en la fase crònica de la enfermedad de Chagas y al xenodiagnòstico, no se puede hablar aùn de cura en forma concluyente debido a la positividad de los mètodos serològicos que puede indicar presencia del paràsito o una memoria inmunològica remanente. Sin embargo, se debe resaltar la disminuciòn, estadìsticamente significativa, de los tìtulos serològicos por los dos mètodos utilizados

Evaluación de un inmunoensayo enzimàtico (ELISA) para el diagnòstico de toxoplasmosis: informe preliminar / Annual reports 1993 / Evaluation of an enzime immunoassay (ELISA) for the diagnosis of toxoplasmosis: preliminary report

Trescientos setenta y dos muestras de suero fueron estudiadas para evaluar la sensibilidad, especificidad, reproductibilidad y estabilidad de una prueba de ELISA "TOXO TEST, IICS" para detecciòn de anticuerpos IgG e IgM anti-Toxoplasma gondii. Los resultados fueron obtenidos por comparaciòn con los mètodos de inmunofluorescencia indirecta, immunoblotting y ELISA doble sandwich. Se determinaron valores de sensibilidad y especificidad mayores a 95 por ciento con un valor predictivo positivo de 98 por ciento en el ELISA IgG que posibilita su utilizaciòn en el diagnòstico serològico en nuestro paìs. Con el mètodo de ELISA IgM se obtuvo alta sensibilidad y especificidad en sueros de pacientes con infecciòn menor o igual a 1 año, pero se obtuvieron reacciones falsas positivas en pacientes sin sintomatologìa clinica que tenian infecciones antiguas o crònicas. En la evaluaciòn se detectò ademàs una estabilidad de 12 meses en todos los componentes del reactivo y la precisiòn interensayo en los sueros controles menor a 20 por ciento de coeficiente de variaciòn. Los resultados obtenidos en la evaluaciòn del "TOXO TEST, IICS" nos muestran la factibilidad de su utilizaciòn en la evoluciòn de una infecciòn aguda por toxoplasmosis y en el diagnòstico de una infecciòn antigua crònica. Sin embargo no se recomienda la utilizaciòn del ELISA IgM para el diagnòstico de infecciòn aguda de un paciente sin sintomatologìa clìnica por las reacciones falsas positivas detectadas en pacientes crònicos, por lo cual se requiere una prueba mas especìfica que elimine los factores de interferencia...

Caracterización de cepas Paraguayas de Trypanosoma Cruzi aislada de pacientes agudos de la enfermedad de Chagas / Characterization of paraguayan Trypanosoma Cruzi strains isolated from acute patients of Chagas disease / Annual Reports 1992

Six Trypanosoma Cruzi Paraguayan strains, isolated from accute chagasic patients, were studied by their behaviour in Bald/C mice, metacylogenesis, biometry of metaciclic froms and lectin agglutination. Early, intermediate and late parasitemic peaks were observed and the strains did not show high virulence. Metacyclogenesis capacity was not higher than 50 percent in all cases, and there were no big differences inthe biometry and lectin agglutination assays. Although previous schizodeme analysis of these strains showed rather homogeneous profiles, biological feautures were quite heterogeneous

Desarrollode una técnica de immunoblotting para Toxoplasma gondii / Annual Reports 1992 / Development of an immunoblotting tenchnique for Toxoplasma Gondii

Proteins from Toxoplasma gondii were separated by SDS-PAGE and then transferred to a nitrocellulose membrane. Antigenic components were then detected by human sera with previously known Toxoplasma antibody levels. Peroxidase-conjugated anti-human immunoglobulins were used for the separated identification of IgG and IgM reactive proteins. IgGand IgM Toxoplasma antibodies showed very different patterns of reaction with antigenic components. IgG Toxoplasma antibodies reacted with numerous antigens of molecular weight ranging from 13000-98000 hDa while IgM Toxoplasma antibodies detected only a few polypeptides with molecular weight ranging from 19000-88000 kDa