RESUMO
Pacientes com câncer de reto (CaRe) em estadio II ou III são tratados com radioquimioterapia neoadjuvante (nCRT), a qual é responsável pela diminuição de recidivas loco-regionais e amputação do esfíncter. A resposta à terapia é variável, incluindo aqueles que não respondem ao tratamento e os que apresentam resposta patológica completa - pCR (15 a 30%). O objetivo deste estudo foi identificar alterações genéticas e epigenéticas que corroborem para a elucidação dos mecanismos de resistência ao tratamento radio e quimioterápico neoadjuvante em pacientes com adenocarcinoma de reto. Foram incluídos 34 CaRe estadio II ou III, submetidos a nCRT. Onze pacientes apresentaram pCR (ypT0N0M0) e 23, resposta patológica incompleta (pIR). Foram utilizadas 10 amostras de reto normal (necrópsias) como referência. As alterações genômicas e de expressão gênica foram avaliadas pelas plataformas CytoScan HD Array e GeneChip Human Transcriptome Array (Affymetrix/Thermo Fisher), respectivamente. O sequenciamento de 105 genes (SureSelectXT Custom Panel, Agilent) relacionados ao câncer foi realizado no NextSeq 550 (Illumina). A plataforma Infinium® Human MethylationEPIC BeadChip (Illumina) foi utilizada para a análise do metiloma. Alterações genômicas identificadas em CaRe evidenciaram alta instabilidade cromossômica e um número significativo de casos com alterações na via de reparo por recombinação homóloga (HR), identificada por mutação em genes da via ou por escores de deficiência (tAI, LST e HDR-LOH). Essas alterações foram corroboradas por vias alteradas relacionadas à regulação das ciclinas e do ciclo celular, assim como do ponto de checagem de reconhecimento de quebras de dupla fita de DNA identificadas por meio do enriquecimento dos genes diferencialmente expressos. A análise integrada dos resultados do metiloma e transcriptômica permitiu a identificação de genes desregulados por metilação os quais foram confirmados com dados externos (TCGA). As diferenças moleculares entre os casos com pCR e pIR incluíram alterações genômica estruturais e um maior index de instabilidade genômica (GII) em pCR. Um maior número de casos com pIR apresentou mutações em genes relacionados à via HR. Esses resultados sugerem que platina e inibidores de PARP1 poderiam ser um tratamento alternativo nos casos com deficiência dessa via. Os perfis de metilação do DNA de cada grupo revelaram maior proporção de sondas hipermetiladas em pCR (44% vs. 18% em pIR). Com base nos dados de três sondas diferencialmente metiladas, foi possível desenvolver um classificador capaz de predizer a resposta à nCRT (100% de sensibilidade e 90% de especificidade). Usando os resultados do transcriptoma, foram identificadas diferentes vias alteradas em CaRe de acordo com a resposta à nCRT. Enquanto os casos com pCR apresentaram vias alteradas relacionadas à resposta do sistema imune e à sinalização de Wnt, o grupo de pIR revelou alterações de controle do ciclo celular e do reparo de quebras de dupla fita de DNA, além de desregulação de mecanismos epigenéticos e de níveis de transcritos. Utilizando os dados de expressão gênica, foi realizada uma análise do secretoma de acordo com a resposta à nCRT, identificando-se ASPH como potencial marcador de pCR. A mesma estratégia revelou UBE2C e CEMIP como marcadores de resistência à nCRT, os quais poderiam ser investigados em biópsias líquidas. Este estudo revelou potenciais marcadores moleculares e mutações que têm potencial para subclassificar os pacientes de acordo com a resposta à terapia atualmente utilizada. Em adição, nossos achados deram evidências de novas estratégias terapêuticas que poderiam ser aplicadas para os pacientes com CaRe
Rectal cancer patients (ReCa) stage II or III undergo neoadjuvant chemoradiotherapy (nCRT), responsible for a decrease in loco-regional recurrence and sphincter amputation. The response to treatment is varied, including patients showing partial or incomplete response to therapy (pIR) and those who achieve pathological complete response - pCR (15 to 30%). The aim of this study was to identify genetic and epigenetic alterations that can be useful to understand the mechanisms of resistance to neoadjuvant chemoradiotherapy in ReCa patients. A total of 34 patients with ReCa stage II or III submitted to nCRT were included. Eleven patients had pCR (ypT0N0M0) and 23 pIR. Ten normal rectal tissue samples (necropsies) were used as reference. Genomic alterations and gene expression profiles were evaluated using the platforms CytoScan HD Array and GeneChip Human Transcriptome Array (Affymetrix/Thermo Fisher), respectively. Targeted nextgeneration sequencing of 105 cancer related genes was performed using the NextSeq 550 (Illumina). The Infinium® Human MethylationEPIC BeadChip (Illumina) platform was used for methylome analysis. High chromosomal instability and a significant number of cases with changes in the DNA damage repair by homologous recombination pathway (HR), identified by mutation in pathway genes or by deficiency scores (tAI, LST and HDR-LOH), were detected in the genomic analysis. These alterations are corroborated by altered pathways related to the regulation of cyclins and the cell cycle, as well as the double-stranded DNA recognition checkpoint identified by the enrichment of the differentially expressed genes. The integrative analysis of differential methylation and transcriptomic results allowed the identification of genes altered by methylation, which were confirmed with external data (TCGA). Molecular differences between pCR and pIR cases included structural genomic changes and a high genomic instability index (GII) in pCR. A higher number of cases with pIR showed mutations in genes related to the HR pathway. These findings suggest that PARP-inhibitors and platinum may be alternative therapeutic approaches for these patients. The DNA methylation profiles of each group revealed a higher proportion of hypermethylated probes in pCR (44% vs. 18% in pIR). Based on data from three differentially methylated probes, a classifier was developed showing the ability of predicting the response to nCRT (100% sensitivity and 90% specificity). Using the transcriptome results, different altered pathways in ReCa were identified according to the response to nCRT. While altered pathways in pCR cases were related to immune system response and Wnt signaling, the pIR group revealed changes in cell cycle control and repair of double stranded DNA breaks, as well as dysregulation of epigenetic mechanisms and transcripts levels. Using the gene expression data, a secretome analysis was performed according to the nCRT response, identifying ASPH as a potential pCR marker. The same strategy revealed UBE2C and CEMIP as markers of nCRT resistance, which could be investigated in liquid biopsies. This study revealed molecular markers and mutations that showed the potential to subclassify the patients according to the response to therapy currently used in the clinical practice. Furthermore, our findings give evidences of novel therapeutic strategies for patients with CaRe