Detection of replication-defective hepatitis A virus based on the correlation between real-time polymerase chain reaction and ELISA in situ results

ELISA in situ can be used to titrate hepatitis A virus (HAV) particles and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) has been shown to be a fast method to quantify the HAV genome. Precise quantification of viral concentration is necessary to distinguish between infectious and non-infectious particles. The purpose of this study was to compare cell culture and RT-PCR quantification results and determine whether HAV genome quantification can be correlated with infectivity. For this purpose, three stocks of undiluted, five-fold diluted and 10-fold diluted HAV were prepared to inoculate cells in a 96-well plate. Monolayers were then incubated for seven, 10 and 14 days and the correlation between the ELISA in situ and RT-PCR results was evaluated. At 10 days post-incubation, the highest viral load was observed in all stocks of HAV via RT-PCR (10(5) copies/mL) (p = 0.0002), while ELISA revealed the highest quantity of particles after 14 days (optical density = 0.24, p < 0.001). At seven days post-infection, there was a significant statistical correlation between the results of the two methods, indicating equivalents titres of particles and HAV genome during this period of infection. The results reported here indicate that the duration of growth of HAV in cell culture must be taken into account to correlate genome quantification with infectivity.

Declining prevalence of hepatitis A virus antibodies among children from low socioeconomic groups reinforces the need for the implementation of hepatitis A vaccination in Brazil

Age-related seroprevalence studies that have been conducted in Brazil have indicated a transition from a high to a medium endemicity of hepatitis A virus (HAV) infection in the population. However, most of these studies have focused on urban populations that experience lower incidence rates of HAV infection. In the current study, the prevalence of anti-HAV antibodies was investigated in children with a low socioeconomic status (SES) that live on the periphery of three capital cities in Brazil. A total of 1,162 dried blood spot samples were collected from individuals whose ages ranged from one-18 years and tested for anti-HAV antibodies. A large number of children under five years old (74.1-90%) were identified to be susceptible to HAV infection. The anti-HAV antibody prevalence reached ≥ 50% among those that were 10-14 years of age or older. The anti-HAV prevalence rates observed were characteristics of regions with intermediate level of hepatitis A endemicity. These data indicated that a large proportion of children with a low SES that live at the periphery of urban cities might be at risk of contracting an HAV infection. The hepatitis A vaccine that is currently offered in Brazil is only available for high-risk groups or at private clinics and is unaffordable for individuals with a lower SES. The results from this study suggest that the hepatitis A vaccine should be included in the Brazilian National Program for Immunisation.

Saliva como espécime clínico para o estudo da hepatite A: aplicações no diagnóstico, na epidemiologia molecular e na patogênese / Saliva as clinical specimen for the study of hepatitis A: usefulness for diagnosis, molecular epidemiology and pathogenesis

No Brasil, surtos de hepatite A em comunidades fechadas, principalmente em creches e escolas, constituem um importante problema para a saúde pública, que requerem investigação epidemiológica e rápida intervenção de controle, devido ao risco de propagação silenciosa para as comunidades próximas. Entretanto, a coleta de sangue é invasiva e dolorosa o que dificulta o acesso à população infantil para a realização do diagnóstico, muitas vezes inviabiliza o estudo epidemiológico quando este envolve um número grande de indivíduos. A coleta de amostras de saliva como uma alternativa, oferece potenciais vantagens, pois se trata de uma coleta não-invasiva, indolor e rápida. A fim de avaliar a utilização da saliva como espécime clínico para o diagnóstico e estudos epidemiológicos da hepatite A, estudos foram conduzidos a partir de amostras pareadas de saliva/soro de pacientes envolvidos em um surto de hepatite A. No primeiro estudo, otimizamos métodos para detecção de anticorpos anti-HAV e do HAV-RNA em amostras de saliva. Neste estudo, observamos sensibilidade e especificidade do teste de detecção de anti-HAV IgM na saliva de 96por cento e 98por cento, respectivamente. Após estabelecer os protocolos para detecção do HAV RNA, verificamos uma alta frequência de detecção de HAV RNA em amostras de saliva tanto de pacientes em fase aguda como em pacientes em período de janela iminológica (37,2por cento). O estudo da epidemiologia molecular conduzido durante o surto revelou co-circulação dos dubgenótipos IA e IB do HAV e a ocorrência de casos de co-infecção por subgenótipos diferentes do HAV entre as amostras pareadas de soro e saliva. Este resultado nos levou a investigação de uma possível replicação extra hepática do HAV em glândulas salivares, através de um estudo de infecção experimental em cinomolgos. Neste estudo constatamos a presença...

Detecção e caracterização molecular do vírus da hepatite A em amostras de saliva / Detection and molecular characterization of the hepatitis A virus in saliva samples

A infecção pelo vírus da hepatite A(HAV)é comum em creches e devido à característica de disseminação assintomática da doença entre crianças,pode gerar surtos principalmente em comunidades fechadas...Foram coletadas amostras pareadas de soro e saliva de 126 indivíduos envolvidos em um surto de hepatite A, ocorrido em outubro de 2004,em uma creche pública no Rio de Janeiro.Todas as amostras foram...da infecção.Para detecção do RNA do HAV em amostras de saliva foram avaliadas duas técnicas:RT-nested-PCR e PCR em tempo real.Em ambas as técnicas vários parâmetros foram avaliados:diferentes métodos de extração do RNA, eficiência de 2 transcriptases reversas e volumes variados de cDNA e Taq Pol.A técnica de RT-nested-PCR apresentou um limite mínimo de detecção de 6x10(ao cubo) cópias/mL,não foi observada a presença de inibidores e não houve relação entre a detecção do HAV na saliva e a presença de sangue nestas amostras.Foi observada uma predominância do RNA do HAV na saliva(50por cento)de pacientes agudos,em relação às amostras de soro(42por cento).Entre as amostras sem marcadores,3 foram positivas no soro e na saliva.A técnica de PCR em tempo real foi padronizada para detecção e quantificação do RNA viral nas amostras de saliva,apresentando sensibilidade de 140 cópias/mL e alta reprodutibilidade.Pela técnica de PCR em tempo real,o RNA do HAV foi detectado em 60por cento das amostras de saliva testadas,entre elas 32 eram anti-HAV IgM positivas e 17 anti-HAV IgM/total negativas.A carga viral média no soro foi de 2,8x10(ao cubo)cópias/mL,e na saliva foi de 1,7x10(ao cubo)cópias/mL,não houve diferença significativa entre estas médias,indicando que não houve associação entre a detecção do RNA do HAV em amostras de saliva e a carga viral no soro.As amostras de soro e de saliva HAV-RNA positivas foram seqüenciadas.As amostras seqüenciadas neste estudo foram todas classificadas como genótipo I.Entre as amostras de soro, 16 foram classificadas como subgenótipo IA e 7 como...