RESUMO
Abstract In this study, a method for expressing Cryptosporidium hominis GP60 glycoprotein in Escherichia coli for production of polyclonal anti-GP60 IgY in chickens was developed aiming future studies concerning the diagnosis, prevention and treatment of cryptosporidiosis. The full-length nucleotide sequence of the C. hominis gp60 gene was codon-optimized for expression in E. coli and was synthesized in pET28-a vector. Subcloning was performed on several different strains of BL21 E. coli. Temperature, time and inducer IPTG concentration assays were also performed and analyzed using SDS-PAGE. The optimal conditions were observed at a temperature of 37 °C, with overnight incubation and 1 mM of IPTG. Purification was performed by means of affinity chromatography using the AKTA Pure chromatography system and the Hi-Trap™ HP column (GE Healthcare). The recombinant protein GP60 (rGP60) thus generated was used to immunize laying hens owing the production of polyclonal IgY. Western blot and indirect immunofluorescence showed that the polyclonal antibody was capable of binding to rGP60 and to Cryptosporidium parvum sporozoites, respectively. The rGP60 and the IgY anti-rGP60 generated in this study may be used as templates for research and for the development of diagnostic methods for cryptosporidiosis.
Resumo Neste trabalho, foi desenvolvido um método de expressão da glicoproteína GP60 de Cryptosporidium hominis em Escherichia coli visando produzir anticorpos IgY anti-GP60 em galinhas para utilização em estudos futuros com os objetivos de diagnóstico, prevenção e tratamento da criptosporidiose. A sequência completa de nucleotídeos do gene gp60 de C. hominis foi códon-otimizada para expressão em E. coli e sintetizada no vetor pET28-a. A subclonagem foi realizada em várias estirpes diferentes de E. coli BL21. Os ensaios de concentração do indutor IPTG, temperatura e tempo foram realizados e analisados por SDS-PAGE. As condições ótimas de expressão foram observadas em temperatura de 37 °C, incubação durante a noite e 1 mM de IPTG. A purificação da proteína foi realizada por cromatografia de afinidade utilizando o sistema de cromatografia AKTA Pure e a coluna Hi-Trap™ HP (GE Healthcare). A proteína recombinante GP60 (rGP60) foi utilizada para imunizar galinhas poedeiras para produzir IgY policlonal anti-rGP60. Verificou-se por Western blot e por imunofluorescência indireta que o anticorpo policlonal apresentou reatividade com a rGP60 e com esporozoítos de Cryptosporidium parvum, respectivamente. A rGP60 e a IgY anti-rGP60 geradas neste estudo podem ser utilizadas como modelos para o desenvolvimento de ensaios para pesquisa e diagnóstico da criptosporidiose.
Assuntos
Animais , Feminino , Imunoglobulinas/imunologia , Galinhas/imunologia , Criptosporidiose/diagnóstico , Cryptosporidium/química , Proteínas Recombinantes/metabolismo , Proteínas Recombinantes/química , Criptosporidiose/imunologia , Escherichia coli/metabolismoRESUMO
O Herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1), membro da subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus, está disseminado mundialmente e tem sido motivo de grande preocupação para criadores e autoridades sanitárias de vários países. Este vírus pode causar rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR), vulvovaginite pustular infecciosa (IPV), balanopostite pustular infecciosa (IPB), conjuntivite e infecções sistêmicas, sendo o aborto uma das consequências mais frequentes. O impacto econômico desta enfermidade é observado pelo retardo do crescimento de animais jovens, menor produção leiteira, morte embrionária e fetal, abortamento, com maior frequência no segundo e terceiro trimestres de gestação, eficiência reprodutiva de matrizes e touros reduzidas, além das restrições ao comércio internacional de animais vivos e seus produtos tais como sêmen e embriões, previstas no Código Internacional de Saúde Animal. Planos de controle e erradicação do vírus têm sido aplicados em alguns países da União Européia através da utilização de vacinas com genes deletados, que permitem a diferenciação entre animais naturalmente infectados e vacinados. O presente estudo teve como objetivo desenvolver ferramentas de diagnóstico e caracterização do BHV-1 baseadas na análise do DNA, que auxiliassem no aprimoramento dos programas de controle e erradicação desse vírus nos rebanhos bovinos. Para isso, foi desenvolvido um teste de nested PCR fluorescente para um fragmento do gene timidina quinase (TK) que permite a detecção e discriminação entre BHV-1 e BHV-5. Foram colhidas 100 amostras de gânglios trigemelares e leucócitos de fêmeas bovinas abatidas em frigorífico, sem histórico de vacinação prévia para BHV-1 e que não apresentavam sinais clínicos da doença. Foi possível diagnosticar por nested PCR fluorescente em 32 amostras de leucócitos e BHV-1 e/ou BHV-5 em 56 gânglios trigemelares, posteriormente confirmados por sequenciamento direto...