RESUMO
Brucellosis is a zoonose produced by bacterial species from the Brucella genus. Its isolation and identification in food using classical microbiological techniques is not practical due to its slow growth rate. Therefore, it is necessary to establish fast and specific methods for the detection of the bacteria in food. The goal of this work was the production and characterization of monospecific polyclonal antibodies in chicken (IgY) against synthetic peptides from Brucella abortus OMP25 and BP26 proteins, suitable for an antigen-capture assay. Conformational as well as antigenic predictions were performed using the ANTHEPROT package. Chemical synthesis was carried out by the multiple manual synthesis using the t-boc strategy. The peptides were used as antigens for the preparation of polyclonal antibodies in chicken. Experimental animals produced specific antibodies against the OMP25 and BP26 peptides constructs determined by ELISA and MABA assays showing correspondence between the predictive study and the immunogenicity obtained in chicken. The IgY proved to be able to recognize B. abortus by MABA assays. The binding activity and specificity of antibodies was determined by Western blot with cell extract from B. abortus. In this study, we demonstrated that OMP25 and BP26 peptides constructs are good candidates for production of specific IgY antipeptide antibodies capable of recognizing proteins from sonicated B. abortus strain S19, indicating the potential usefulness of the IgY antibody for development of immunoassays for detection of Brucella abortus.
La brucelosis es una zoonosis producida por especies del género Brucella. El aislamiento e identificación de la bacteria en alimentos usando las técnicas clásicas de microbiología no es práctico debido a su lenta tasa de crecimiento. Por lo tanto, es necesario establecer métodos rápidos para la detección de la bacteria en alimentos. En el presente trabajo se desarrollaron y caracterizaron anticuerpos policlonales monoespecíficos en gallinas (IgY) contra péptidos sintéticos de las proteínas OMP25 y BP26 de Brucella abortus, que puedan ser utilizados en un ensayo de captura. Para ello, se realizaron estudios conformacionales y de predicción de epítopes en la selección de los péptidos, los cuales se utilizaron como antígenos para la producción de las IgY. Los animales desarrollaron anticuerpos específicos contra los péptidos, mostrando correspondencia entre los estudios predictivos y la inmunogenicidad obtenida. Las IgY reconocieron a B. abortus en un ensayo de MABA y la actividad de unión y especificidad fue determinada por western blot con extracto celular de B. abortus. En este estudio, demostramos que los péptidos de las proteínas OMP25 y BP26 de B. abortus son buenos candidatos para la producción de anticuerpos IgY especificos capaces de reconocer proteínas de extracto de B. abortus cepa S19, indicando el potencial uso de anticuerpos IgY para el desarrollo de inmunoensayos para la detección de Brucella abortus.
RESUMO
Understanding the mode of Schistosoma mansoni larval invasion and the mechanism of immune evasion utilized by larvae and adult worms is essential for a rational development of vaccines or drugs to prevent or cure the disease. This parasite has a very complex molecular organization in all parasite stages, and identifying the major parasite proteins would give clues to schistosome metabolism and to the interaction of the parasite with the host immune system. Our goal was the evaluation of the protein parasite repertoire using a proteomic approach, and the characterization of protein extracts from two different parasite stages of a Venezuelan isolate, such as cercariae and adult worms, previously performed by other authors in some other strains. A comparison among authors was made. Besides, we aimed to identify different isoforms of one of the vaccine candidates, the gluthation-S-transferase protein (Sm28GST), by 2D SDS-PAGE and mass spectrometry, and to achieve its immunologic detection using sera from rabbits immunized with synthetic peptides derived from the Sm28GST protein. These techniques allowed the identification of some of the target molecules of the protective immune response that are being evaluated as potential members of a multi-component and multi-stage anti-S. mansoni vaccine and to clarify if the selected peptides induce antibodies that are able to recognize different isoforms of the Sm28GST.
Es esencial comprender la forma como las larvas de Schistosoma mansoni invaden y los mecanismos de evasión inmune utilizados por larvas y adultos, para el desarrollo racional de vacunas o drogas para prevenir o curar la esquistosomiasis. Este parásito tiene una organización molecular muy compleja en todos sus estadíos, por lo que la identificación de las proteínas más importantes es clave para investigar el metabolismo del esquistosoma y la interacción del parásito con el sistema inmune del hospedero. El objetivo de este trabajo fue evaluar el repertorio proteico del parásito utilizando una aproximación proteómica y la caracterización de extractos proteicos de dos estadios parasitarios diferentes de un aislado venezolano, como la cercaria y el verme adulto, previamente realizado por otros autores en otras aislados. Se realizó una comparación entre autores. Además, se identificaron diferentes isoformas de uno de los candidatos a vacuna, la glutation S transferasa (Sm28GST) por 2D SDS-PAGE y espectrometría de masas y se logró su detección inmunológica, usando sueros de conejos inmunizados con péptidos sintéticos derivados de la proteína Sm28GST. Estas técnicas permitieron identificar algunas de las moléculas blanco de la respuesta inmune protectora que están siendo evaluados como miembros potenciales de una vacuna multi-estadio y multi-componente y aclarar si los péptidos seleccionados indujeron anticuerpos capaces de reconocer diferentes isoformas de la Sm28GST.
Assuntos
Animais , Antígenos de Bactérias/genética , Antígenos de Bactérias/imunologia , Glutationa Transferase/genética , Glutationa Transferase/imunologia , Proteínas de Helminto/genética , Schistosoma mansoni/genética , Schistosoma mansoni/imunologia , Cercárias , Proteômica , Vacinas , VenezuelaRESUMO
El diagnóstico de laboratorio de la esquistosomosis es uno de los problemas por resolver, especialmente en áreas de bajas cargas parasitarias, como Venezuela, además de ser también una de las limitantes la evaluación de las nuevas vacunas contra esta parasitosis. Por esta razón, nos planteamos desarrollar métodos de inmunodiagnóstico basados en la detección de anticuerpos y de antígenos circulantes utilizando la estrategia de la síntesis química, para elaborar péptidos derivados de la captesina B (Sm31) y la asparraginil endopeptidasa (Sm32). Tres de los péptidos de la Sm31 fueron reconocidos al menos por el 49 por ciento de los pacientes y de ellos el IMT-180, lo fue por el 86 por ciento, exhibiendo además una alta especificidad (100 por cierto). Dos de los péptidos de la Sm31 y 3 de la Sm32 indujeron en conejos, el reconocimiento de las respectivas moléculas, inclusive en cortes histológicos. Resultados preliminares de inmunoensayos de captura anti-Sm32 han revelado una baja sensibilidad