Assessment of genotyping markers in the molecular characterization of a population of clinical isolates of Fusarium in Colombia / Evaluación de marcadores de genotipificación en la caracterización molecular de una población de aislamientos clínicos de Fusarium en Colombia

Introduction: Fusarium is a very heterogeneous group of fungi, difficult to classify, with a wide range of living styles, acting as saprophytes, parasites of plants, or pathogens for humans and animals. Prevalence of clinical fusariosis and lack of effective treatments have increased the interest in the precise diagnosis, which implies a molecular characterization of Fusarium populations. Objective: We compared different genotyping markers in their assessment of the genetic variability and molecular identification of clinical isolates of Fusarium. Materials and methods: We evaluated the performance of the fingerprinting produced by two random primers: M13, which amplifies a minisatellite sequence, and (GACA)4, which corresponds to a simple repetitive DNA sequence. Using the Hunter Gaston Discriminatory Index (HGDI), an analysis of molecular variance (AMOVA), and a Mantel test, the resolution of these markers was compared to the reference sequencing-based and PCR genotyping methods. Results: The highest HGDI value was associated with the M13 marker followed by (GACA)4. AMOVA and the Mantel tests supported a strong correlation between the M13 classification and the reference method given by the partial sequencing of the transcription elongation factor 1-alpha (TEF1-α) and rDNA 28S. Conclusion: The strong correlation between the M13 classification and the sequencing-based reference together with its higher resolution demonstrates its adequacy for the characterization of Fusarium populations.

Introducción. Fusarium es un grupo heterogéneo de hongos, difícil de clasificar y con una amplia gama de estilos de vida, que actúa como saprófito, parásito de plantas o patógeno de humanos y animales. La prevalencia de la fusariosis clínica y la falta de tratamientos han incrementado el interés en su diagnóstico preciso, lo que conlleva la caracterización molecular de las poblaciones. Objetivo. Comparar marcadores de genotipificación en la evaluación de la variabilidad genética e identificación de aislamientos clínicos de Fusarium. Materiales y métodos. Se evaluó la huella genética producida por dos cebadores aleatorios: M13, que amplifica una secuencia minisatélite, y (GACA)4, que corresponde a una secuencia repetitiva de ADN. Utilizando el índice discriminatorio de Hunter Gaston (HGDI), el análisis de varianza molecular (AMOVA) y una prueba de Mantel, se comparó la resolución de estos marcadores con métodos de genotipificación basados en secuenciación y PCR. Resultados. El mayor HGDI se asoció con el marcador M13, seguido de (GACA)4. Las pruebas AMOVA y Mantel mostraron correlación entre las clasificaciones obtenidas con M13 y la referencia basada en la secuenciación parcial del factor de elongación de transcripción 1-alfa (TEF1-α) y el ADNr 28S. Conclusión. La fuerte correlación entre la clasificación obtenida con M13 y el método de referencia, así como su alta resolución, demuestran su idoneidad para la caracterización de poblaciones de Fusarium.

Concordance analysis between different methodologies used for identification of oral isolates of Candida species / Análisis de concordancia de diferentes metodologías para la identificación de aislamientos orales de especies de Candida

Abstract Background: The yeasts species determination is fundamental not only for an accurate diagnosis but also for establishing a suitable patient treatment. We performed a concordance study of five methodologies for the species identification of oral isolates of Candida in Colombia. Methods: Sixty-seven Candida isolates were tested by; API® 20C-AUX, Vitek®2 Compact, Vitek®MS, Microflex® and a molecular test (panfungal PCR and sequencing). The commercial cost and processing time of the samples was done by graphical analysis. Results: Panfungal PCR differentiated 12 species of Candida, Vitek®MS and Microflex® methods identified 9 species, and API® 20C-AUX and Vitek®2 Compact methods identified 8 species each. Weighted Kappa (wK) showed a high agreement between Panfungal PCR, Vitek®MS, Microflex® and API® 20C-AUX (wK 0.62-0.93). The wK that involved the Vitek®2 Compact method presented moderate or good concordances compared with the other methods (wK 0.56-0.73). Methodologies based on MALDI TOF MS required 4 minutes to generate results and the Microflex® method had the lowest selling price. Conclusion: The methods evaluated showed high concordance in their results, being higher for the molecular methods and the methodologies based on MALDI TOF. The latter are faster and cheaper, presenting as promising alternatives for the routine identification of yeast species of the genus Candida.

Resumen Introducción: La clasificación a nivel de especies de las levaduras del género Candida de origen clínico es fundamental para el diagnóstico y la instauración de un adecuado tratamiento para el paciente. Se realizó un estudio de concordancia de cinco metodologías usadas para la identificación de aislamientos orales de Candida spp en Colombia. Métodos: Sesenta y siete aislamientos de Candida spp fueron identificados a nivel de especie utilizando; API® 20 C AUX‚ Vitek® 2 Compact, MALDI TOF (Vitek® MS y Microflex®) y una prueba molecular, PCR Panfungal y secuenciación. Un análisis del costo comercial y tiempo de procesamiento de las muestras por cada método fue realizado mediante el análisis gráfico de ambas variables. Resultados: La PCR Panfungal y secuenciación diferenció 12 especies de Candida‚ los métodos Vitek® MS y Microflex® identificaron 9 especies y los métodos API® 20 C AUX y Vitek® 2 Compact identificaron 8 especies. El análisis de Kappa ponderado (wK) demostró una concordancia alta entre los métodos PCR Panfungal y secuenciación‚ Vitek® MS‚ Microflex® y API® 20 C AUX‚ concordancias agrupadas en las categorías buena y muy buena (wK 0.62 - 0.93); los Kp que involucraron el método Vitek® 2 Compact presentaron concordancias moderadas o buenas frente a los otros métodos (wK 0.56 - 0.73). Las metodologías basadas en MALDI TOF MS requirieron 4 minutos para generar un resultado y el método Microflex® fue el método que en nuestro medio presentó el menor precio de venta del servicio. Conclusión: Los métodos evaluados presentaron una alta concordancia en sus resultados‚ siendo más alta para los métodos moleculares y las metodologías basadas en MALDI TOF MS; estas últimas son metodologías más rápidas, económicas y precisas, las cuales se presentan como alternativas prometedoras para la identificación rutinaria de especies de levaduras del género Candida.

Adaptación al español y validación de criterio de una escala para la tamización de problemas emocionales y del comportamiento en la primera infancia / Adaptation to Spanish and criterion validity of a scale for the screening of emotional and behavioral problems in early childhood

Resumen Introducción. La detección temprana del riesgo de problemas emocionales y del comportamiento en niños puede contribuir al desarrollo de estrategias que promuevan la salud mental desde la primera infancia. En Colombia no existe una herramienta validada para dicha detección. Objetivos. Seleccionar, adaptar y establecer la validez de criterio de una escala de tamización de problemas emocionales y del comportamiento en niños menores de seis años. Materiales y métodos. A partir de una revisión de la literatura y un consenso de expertos, se seleccionó la herramienta Early Childhood Screening Assessment (ECSA). Posteriormente, se llevó a cabo su adaptación lingüística y se determinó la validez de criterio mediante una curva de características de recibidor-operador (Receiver Operating Characteristic, ROC), y se la comparó con el cuestionario Child Behavior Checklist (CBCL 1,5-5). En el estudio participaron 206 cuidadores de niños entre el año y medio y los seis años de edad de la ciudad de Tunja y el municipio de Sopó. Resultados. La puntuación del ECSA presentó una buena correlación con la puntuación t total del CBCL 1,5-5 (ro de Spearman=0,75; p<0,01). La escala ECSA tuvo una sensibilidad de 86 % y una especificidad de 82 % al establecer un punto de corte de 24 para la población estudiada. Conclusión. En este primer estudio de adaptación y validación de la versión en español de la escala ECSA, se detectaron buenos valores de sensibilidad y especificidad para la tamización de problemas emocionales y del comportamiento en la primera infancia.

Abstract Introduction: Early identification of emotional and behavioral risk in children can contribute to the development of strategies that promote mental health from early childhood. In Colombia, we do not count with a validated screening tool for emotional and behavioral problems in this population. Objectives: To identify, adapt, and establish evidence for the criterion validity of a screening tool for emotional and behavioral problems in less than 6-year-old children. Materials and methods: We selected the Early Childhood Screening Assessment (ECSA) after a literature review and expert consensus and then we undertook its linguistic adaptation. For criterion validity, we used the Receiver Operating Characteristic (ROC) comparing the scale with the Child Behavior Checklist (CBCL 1,5-5). The sample included 206 caregivers of children between 1.5 and 6 years of age from the city of Tunja and the municipality of Sopó. Results: The ECSA showed a good correlation with the total t-score of the CBCL 1,5-5 (Spearman rho= 0,75, p<0,01). The scale showed a sensitivity of 86% and a specificity of 82% at a cut-off point of 24. Conclusion: In this first adaptation to Spanish and validation study of the ECSA scale, we found good sensitivity and specificity values for the screening of emotional and behavioral problems in early childhood.

GSTT1 and GSTM1 null variants in Mestizo and Amerindian populations from northwestern Mexico and a literature review

Abstract The GSTT1 and GSTM1 genes are key molecules in cellular detoxification. Null variants in these genes are associated with increase susceptibility to developing different types of cancers. The aim of this study was to determine the prevalence of GSTT1 and GSTM1 null genotypes in Mestizo and Amerindian individuals from the Northwestern region of Mexico, and to compare them with those reported worldwide. GSTT1 and GSTM1 null variants were genotyped by multiplex PCR in 211 Mestizos and 211 Amerindian individuals. Studies reporting on frequency of GSTT1 and GSTM1 null variants worldwide were identified by a PubMed search and their geographic distribution were analyzed. We found no significant differences in the frequency of the null genotype for GSTT1 and GSM1 genes between Mestizo and Amerindian individuals. Worldwide frequencies of the GSTT1 and GSTM1 null genotypes ranges from 0.10 to 0.51, and from 0.11 to 0.67, respectively. Interestingly, in most countries the frequency of the GSTT1 null genotype is common or frequent (76%), whereas the frequency of the GSMT1 null genotype is very frequent or extremely frequent (86%). Thus, ethnic-dependent differences in the prevalence of GSTT1 and GSTM1 null variants may influence the effect of environmental carcinogens in cancer risk.

Desarrollo socio-cognitivo en la primera infancia: los retos por cumplir en salud pública en la zona Sabana Centro y Boyacá / Socio-cognitive development in early childhood: the challenges to reach in public health at the area of Sabana Centro and Boyacá

RESUMEN Objetivo La necesidad de construir sistemas de salud pública que garanticen el desarrollo infantil integral, permite realizar una caracterización de los factores que favorecen o limitan el desarrollo integral de niñas y niños menores de seis años, para identificarlos como componentes necesarios a ser tenidos en cuenta en políticas públicas. Método Se realizó una encuesta a 1 177 madres o cuidadores de niños menores de seis años en 16 municipios de Cundinamarca y Boyacá, y se midió el respectivo desarrollo socio-cognitivo de los menores participantes con la tabla Haizea-Llevant y tareas relacionadas con el uso de sistemas de conocimiento intra-específicos. Resultados Mediante análisis estadísticos bivariados y multivariados se encontró que los factores que resultan significativos para atender a una propuesta de salud pública que busque el desarrollo integral de los niños menores de seis años son: las condiciones socio-económicas de los hogares, las complicaciones en el parto, la edad de inicio de alimentos sólidos, los tiempos de trabajo de las madres, la reglas sobre rutinas diarias y las prácticas de juego: lectura, pintura y actividades deportivas. Conclusiones Un sistema de salud que reconozca los resultados presentados, debería ofrecer atención especializada que procure el bienestar en la infancia y la niñez temprana, lo cual solo puede lograrse si las políticas de salud comienzan a considerar factores de orden doméstico y cotidiano que no pueden estar por fuera de políticas públicas, asegurando diversos niveles de intervención, impacto social y particular.(AU)

ABSTRACT Objective The need to build public health systems that ensure comprehensive child development enables a characterization of the factors that favor or restrict the integral development of children under the age of six. That is in order to identify them as necessary components to be taken into account in public policies. Method A survey was carried out with 1 177 mothers or family caregivers of children under six years old in 16 municipalities of Cundinamarca and Boyacá, and the respective socio-cognitive development of their own sons and daughters was measured with the Haizea-Llevant table and also tasks related to the use of core knowledge systems. Results Through bivariate and multivariate statistical analyzes, it was found that the factors that are significant to address a public health proposal that seeks the integral development of children under six years of age are: socio-economic conditions of households, complications in childbirth, the starting age of solid foods, mothers' working shifts, rules on daily routines and play practices such as reading, painting and sport activities. Conclusions A health system that acknowledges the results presented should offer specialized care that seeks welfare in childhood and early childhood, which can only be achieved if health policies begin to consider domestic and daily factors that cannot be excluded from public policies and it should guarantee different levels of intervention of social and particular impact.(AU)

Epidemiología de la tinea capitis: 19 años de experiencia en un laboratorio clínico especializado en Colombia / Epidemiology of tinea capitis: A 19 years' experience in a Colombian, specialized clinical laboratory

Introducción: En la literatura colombiana son escasos los reportes acerca de la epidemiología de la tinea capitis. Objetivo : Realizar un estudio retrospectivo para describir el comportamiento de esta micosis y de sus agentes etiológicos, en una serie de pacientes remitidos a un centro de diagnóstico especializado en Medellín, Colombia. Métodos : Estudio retrospectivo donde se analizaron los registros de pacientes remitidos entre los años 1994 y 2013 para estudio micológico a la Unidad de Micología Médica y Experimental de la Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB), en Medellín, Colombia. Resultados : Fueron analizados 415 pacientes con sospecha clínica de tinea capitis, 133 (32%) de los cuales fueron confirmados por el laboratorio. La mayoría de los pacientes positivos, 124/133 (93%), fueron menores de edad y 89/133 (67%) correspondieron al sexo masculino. En 52 de los 133 casos comprobados se pudo determinar algún factor de riesgo asociado: el contacto con animales fue el principal factor de riesgo en 39/52 pacientes (75%). El examen directo fue positivo en el 87% y el cultivo para hongos en el 92% de los casos comprobados. El agente etiológico más frecuentemente aislado fue Microsporum canis (86%), seguido con una amplia diferencia por Microsporum gypseum(4%), Trichophyton tonsurans (3%), Trichophyton mentagrophytes (3%), Microsporum audouinii (3%) y Microsporum spp. (1%). Conclusión : Nuestros resultados representan una casuística importante para la epidemiología de la tinea capitis en Colombia. En ausencia de estudios más extensos en cobertura geográfica y en población estudiada que permitan conocer la incidencia real de esta micosis en nuestro medio, estos datos deben ser considerados como aporte valioso en el conocimiento de los agentes etiológicos de tinea capitis más frecuentes en el país.

Introduction: There are few written reports on the epidemiology of tinea capitis in Colombia. Objective: To undertake a retrospective study (1994-2013) aimed at describing the behavior of this mycosis and its etiological agents, using a series of patients referred to a specialized diagnostic center in Medellin, Colombia. Methods: This is a retrospective study in which the records were analysed of patients from 1994-2013, who were referred for mycological studies (direct examination and culture) to the Medical and Experimental Mycology Unit of the Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB) with the clinical suspicion of tinea capitis. Results: In this period, 415 patients with clinical suspicion of tinea capitis were reported, of which 133 cases were confirmed by the laboratory (32%); most patients 124 (93%) were children, mostly boys 89 (67%). In terms of associated risk factors there was information from 52 confirmed cases, of which 39 (75%) had contact with animals. Direct examination was positive in 87% and fungal culture in 92% of confirmed cases; the etiologic agent most isolated was Microsporum canis (86%), followed by Microsporum gypseum (4%), Trichophyton tonsurans (3%), Trichophyton mentagrophytes (3%), Microsporum audouinii (3%) and Microsporum spp. (1%). Conclusion: Our results represent an important casuistry for the epidemiology of tinea capitis in Colombia. In the absence of more extensive studies on geographic coverage and population characteristics that reveal the true incidence of this mycosis in our country, these data should be considered a valuable contribution to the understanding of the most frequent etiologic agents of tinea capitis in Colombia.

Validation and clinical application of a molecular method for the identification of Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii complex DNA in human clinical specimens

ABSTRACT The diagnosis of cryptococcosis is usually performed based on cultures of tissue or body fluids and isolation of the fungus, but this method may require several days. Direct microscopic examination, although rapid, is relatively insensitive. Biochemical and immunodiagnostic rapid tests are also used. However, all of these methods have limitations that may hinder final diagnosis. The increasing incidence of fungal infections has focused attention on tools for rapid and accurate diagnosis using molecular biological techniques. Currently, PCR-based methods, particularly nested, multiplex and real-time PCR, provide both high sensitivity and specificity. In the present study, we evaluated a nested PCR targeting the gene encoding the ITS-1 and ITS-2 regions of rDNA in samples from a cohort of patients diagnosed with cryptococcosis. The results showed that in our hands, this Cryptococcus nested PCR assay has 100% specificity and 100% sensitivity and was able to detect until 2 femtograms of Cryptococcus DNA.

THE POWER OF THE SMALL: THE EXAMPLE OF Paracoccidioides brasiliensis CONIDIA / O poder do pequeno: o exemplo dos conídios do Paracoccidioides brasiliensis

SUMMARYResearch on Paracoccidioides brasiliensis has centered in the yeast cell probably because of the lack of distinctive features in the mycelium. In 1942 and for the first time, lateral conidia were noticed in the fungus' hyphae. Later on, Brazilian, Venezuelan and Argentinean researchers described "aleurias" when the fungus was grown in natural substrates. In 1970 authors became interested in the conidia and were able to obtain them in large numbers and treat them as individual units. Their shape and size were defined and the presence of all the elements of a competent eukaryotic cell were demonstrated. Conidia exhibited thermal dimorphism and, additionally, when given intranasally to BALB/c male mice, they converted into yeasts in the lungs and produce progressive pulmonary lesions with further dissemination to other organs. Studies on the phagocyte-conidia interaction were revealing and showed that these versatile structures allow a better understanding of the host- P. brasiliensisinteractions.

RESUMOA investigação sobre Paracoccidioides brasiliensis tem-se centrado na célula de levedura, provavelmente devido à falta de características distintas no micélio. Em 1942 e, pela primeira vez, conídios laterais foram notados nos hifas dos fungos. Mais tarde, pesquisadores brasileiros, venezuelanos e argentinos descreveram "aleurias" quando o fungo foi cultivado em substratos naturais. Em 1970, os autores se interessaram pelos conídios e foram capazes de obtê-los em grande número e tratá-los como unidades individuais. A sua forma e tamanho foram definidos, e a presença de todos os elementos de uma célula eucariótica competente foram demonstrados. Conídios apresentam dimorfismo térmico e, além disso, quando administrados por via intranasal a camundongos BALB/c machos, são convertidos em leveduras nos pulmões e produzem lesões pulmonares progressivas com posterior disseminação para outros órgãos. Estudos sobre a interação de fagócitos-conídios foram reveladores e mostraram que estas estruturas versáteis permitem melhor compreensão das interacções entre hospedeiro e P. brasiliensis.

Validation and clinical application of a nested PCR for paracoccidioidomycosis diagnosis in clinical samples from Colombian patients

Paracoccidioidomycosis is a systemic and endemic mycosis, restricted to tropical and subtropical areas of Latin America. The infection is caused by the thermal dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensisand Paracoccidioides lutzii. The diagnosis of paracoccidioidomycosis is usually performed by microscopic examination, culture and immunodiagnostic tests to respiratory specimens, body fluids and/or biopsies; however these methods require laboratory personnel with experience and several days to produce a result. In the present study, we have validated and evaluated a nested PCR assay targeting the gene encoding the Paracoccidioides gp43membrane protein in 191 clinical samples: 115 samples from patients with proven infections other than paracoccidioidomycosis, 51 samples as negative controls, and 25 samples from patients diagnosed with paracoccidioidomycosis. Additionally, the specificity of the nested PCR assay was also evaluated using purified DNA isolated from cultures of different microorganisms (n= 35) previously identified by culture and/or sequencing. The results showed that in our hands, this nested PCR assay for gp43 protein showed specificity and sensitivity rates of 100%. The optimized nested PCR conditions in our laboratory allowed detection down to 1 fg of P. brasiliensisDNA.

Comparación del cultivo celular de HeLa y HEp-2: Perspectivas de estudios con Chlamydia trachomatis / Comparison of cell culture HeLa and HEp-2: Studies prospects Chlamydia trachomatis

Objetivo. Estandarizar el cultivo de células HeLa en diferentes condiciones, con el fin de utilizarlo en protocolos de infección con Chlamydia trachomatis serovar L2. Materiales y métodos. Este estudio se llevó a cabo en cuatro fases principales que son: 1.Viabilidad celular por la técnica de azul de tripán y su posterior observación, 2. Estandarización del cultivo de células HeLa, 3. Coloración de Giemsa, 4. Cultivo de células HEp-2.Resultados. Se determinó que la línea celular HeLa debe ser cultivada en medio DMEM, 0,1% de L- glutamina, 10% de SFB. Así mismo, que la coloración de Giemsa es mejor realizarla en un tiempo de 40 minutos por que se evidencia una clara definición de núcleo y citoplasma. Frente a la comparación de las dos líneas celulares se obtuvo que la línea HeLa desde el primer día muestra un crecimiento adecuado y alcanza rápidamente la confluencia esperada, en contraposición la línea HEp-2 presenta un crecimiento más lento pero alcanzando la confluencia deseada al último día.

Objective. The goal of this study was to standardize the cultivation of HeLa cells under different conditions, to be used in Chlamydia trachomatis serovar L2 infection's protocols. Materials and Methods. This study was conducted in four phases that are: 1.Cell Viabilidad by trypan blue technique and his subsequent remark, 2. Standardization HeLa cell culture, 3. Giemsa, 4. Cultivation of Hep-2 cells. Results. As a result of standardization it is determined that the HeLa cell line should be cultured in DMEM, 0.1% L-glutamine, 10% FBS.It was determined that the Giemsa perform better over time of 40 minutes that a clear definition of nucleus and cytoplasm is evident. Comparing against both cell lines HeLa was obtained that the line from day growing well and quickly reaches the expected confluence, the opposed line HEp-2 has a slower growth but achieving the desired confluence the last day.

Interaction between Paracoccidioides brasiliensis conidia and the coagulation system: involvement of fibrinogen

The infectious process starts with an initial contact between pathogen and host. We have previously demonstrated that Paracoccidioides brasiliensis conidia interact with plasma proteins including fibrinogen, which is considered the major component of the coagulation system. In this study, we evaluated the in vitro capacity of P. brasiliensis conidia to aggregate with plasma proteins and compounds involved in the coagulation system. We assessed the aggregation of P. brasiliensis conidia after incubation with human serum or plasma in the presence or absence of anticoagulants, extracellular matrix (ECM) proteins, metabolic and protein inhibitors, monosaccharides and other compounds. Additionally, prothrombin and partial thromboplastin times were determined after the interaction of P. brasiliensis conidia with human plasma. ECM proteins, monosaccharides and human plasma significantly induced P. brasiliensis conidial aggregation; however, anticoagulants and metabolic and protein inhibitors diminished the aggregation process. The extrinsic coagulation pathway was not affected by the interaction between P. brasiliensis conidia and plasma proteins, while the intrinsic pathway was markedly altered. These results indicate that P. brasiliensis conidia interact with proteins involved in the coagulation system. This interaction may play an important role in the initial inflammatory response, as well as fungal disease progression caused by P. brasiliensis dissemination.

Utilidad de la muestra de la lámina ungular en el diagnóstico de onicomicosis / Usefulness of nail plate sample in the diagnosis of onychomycosis

Introducción. La sensibilidad de las pruebas convencionales (examen directo, cultivo) para el diagnóstico de la onicomicosis (25 a 80%), representa un problema para la decisión terapéutica del dermatólogo. Objetivo. Determinar la exactitud diagnóstica de la muestra de la lámina ungular en pacientes con diagnóstico clínico de onicomicosis. Metodología. Es un estudio prospectivo de pruebas diagnósticas en 50 pacientes con sospecha de onicomicosis. Se tomó muestra de la lámina ungular con cortaúñas estéril en el área de onicólisis para pruebas micológicas (KOHcultivo) y de histopatología (hematoxilina y eosina y ácido peryódico de Schiff), y muestra de detritos mediante raspado del lecho para prueba micológica. La toma de muestras y el procesamiento de las pruebas se realizaron en laboratorios de referencia y se interpretaron de manera ciega e independiente. La muestra de detritos se consideró la prueba estándar. Resultados. Se observó compromiso de los pies en 90% de los pacientes, 86,6% con afectación del primer dedo. La prueba micológica de detritos fue positiva en 80% de los casos, encontrándose estructuras micóticas en el examen directo en 72% y aislamiento al cultivo en 64%. En la lámina ungular, la sensibilidad fue de 87,5% y la especificidad de 80%; el cociente de probabilidades positivo fue 4,4. Cinco muestras positivas con la tinción PAS fueron negativas en la prueba estándar. La sensibilidad neta aumentó a 95% mediante el análisis de las pruebas en paralelo de la lámina ungular. La mayoría de los aislamientos fueron especies de Candida (77,3% en detritos y 75,9% en la lámina ungular), y C. parapsilosis fue el aislamiento más frecuente. Conclusión. Se propone la muestra de la lámina ungular para pruebas micológicas y tinción de PAS, como complemento a la muestra de detritos para el diagnóstico de onicomicosis.

Detección e identificación de Histoplasma capsulatum por el laboratorio: de los métodos convencionales a las pruebas moleculares / Detection and identification of the fungal pathogen Histoplasma capsulatum: from conventional to molecular methods

La histoplasmosis, micosis sistémica y endémica en una amplia zona de las Américas, es causada por el hongo dimórfico Histoplasma capsulatum. Tradicionalmente, el diagnóstico de esta entidad se realiza por métodos microbiológicos directos y biopsias que emplean una variedad de coloraciones especiales tales como Wright, Giemsa y plata metenamina, entre otras, así como por cultivo; este último representa el estándar de oro. Se emplean, igualmente, métodos indirectos que incluyen la detección de anticuerpos y antígenos. Los valores de sensibilidad y especificidad en ambos métodos son variables, y los resultados dependen, a su vez, de la forma clínica de la enfermedad que presente el paciente y de su estado inmune. Recientemente, la biología molecular ha permitido introducir nuevas herramientas que han sido utilizadas para la detección e identificación de H.capsulatum, una de ellas es la PCR anidada que se caracteriza por sus altos niveles de sensibilidad y especificidad. De igual forma, estas técnicas moleculares han permitido realizar análisis evolutivos, estudios de diversidad genética y un sinnúmero de estudios de epidemiología molecular, a partir de los cuales se ha logrado recopilar información valiosa sobre la variabilidad genética de este microorganismo. En esta revisión se describen los métodos de laboratorio convencionales y las técnicas moleculares más empleadas para el diagnóstico de la histoplasmosis; así como también algunas de sus aplicaciones en la epidemiología y biología molecular de este hongo.

Histoplasma capsulatum is the causative agent of histoplasmosis, a systemic and endemic mycosis widely distributed in the Americas. Diagnosis of histoplasmosis is traditionally accomplished by means of direct preparations and biopsies stained by especial methods, as well as by isolation of fungus in culture; the latter is considered the gold standard. Indirect methods, including immunological tests to detect antibodies and/or antigens, are also valuable; both direct and indirect methods present sensitivity and specificity ranges that vary depending on the clinical form of the disease and the immune status of the host. Recently, molecular biology has allowed implementing new tools to detect and identify H. capsulatum, and several molecular tests, such as nested-PCR, are being used for the diagnosis of histoplasmosis, and so provide high sensitivity and specificity values. In addition, these molecular techniques have made it possible to perform evolution analysis, genetic diversity research, and molecular epidemiology, thus compiling valuable information on the genetic variability of this microorganism. In this review, the conventional and molecular methods employed for the diagnosis of histoplasmosis have been described, as have some of the applications of these molecular techniques to this fungal pathogen's epidemiology and molecular biology.

Identificación de algunos genes asociados al proceso de germinación de la conidia al micelio en Paracoccidioides brasiliensis / Identification of genes associated with germination of conidia to form mycelia in the fungus Paracoccidioides brasiliensis

Introducción. Paracoccidioides brasiliensis es un hongo dimórfico térmico, que a temperatura ambiente se presenta como un moho productor de conidias, mientras que en el huésped se comporta como una levadura de gemación múltiple. Los mecanismos moleculares que rigen la germinación de conidia a micelio aún se desconocen. Objetivo. Estudiar en P. brasiliensis la cinética del proceso de germinación de conidia a micelio y determinar los genes expresados durante este proceso mediante la construcción y el análisis de una librería EST (Expressed Sequence Tag). Materiales y métodos. Para el estudio de la cinética de germinación, se produjeron y aislaron conidias de P. brasiliensis. Estas fueron incubadas en cultivos líquidos a 18°C por 24, 48, 72 y 96 horas, y se examinaron por microscopía de luz. A partir de conidias cultivadas por 96 horas, se construyó y caracterizó una librería EST, la cual representaría los genes expresados durante el proceso de germinación. Resultados. Durante el proceso de germinación de conidia a micelio, se observó 11,7±1,2%, 30±0,6%, 43±1,3% y 66±2,4% de germinación a las 24, 48, 72 y 96 horas de incubación, respectivamente. Además, se obtuvo una librería del proceso de germinación consistente en 129 secuencias agrupadas en cuatro secuencias contiguas y siete secuencias únicas, para un total de 11 posibles genes. Ocho secuencias (72,7%) no habían sido descritas anteriormente en otras librerías informadas para este hongo y podrían representar genes específicos de la germinación de conidia a micelio. Conclusiones. Éste es el primer reporte en el que se identifican genes no descritos anteriormente, que son expresados durante la germinación de conidia a micelio, proceso de gran importancia en la biología de P. brasiliensis.

Introduction. Paracoccidioides brasiliensis is a thermo-dimorphic fungus. At room temperature it grows as a mold that produces conidia, whereas in the vertebrate host it grows as a multiple-budding yeast. The molecular mechanisms involved in the germination from the conidia to the mycelia process remain unknown. Objective. The kinetics of conidia to mycelia germination process were studied in the dimorphic fungus P. brasiliensis. Gene expression during this process was evaluated by construction and analysis of an EST library. Materials and methods. For the germination kinetics study, P. brasiliensis conidia were isolated as single cell units. Then, they were cultured at 18° C in BHI (brain-heart infusion) broth for 24, 48, 72 and 96 hr. After each perion, they were examined by light microscopy. From conidia harvested at 96 hr, an EST library was constructed; at this stage the gene expression was presumed to be maximal for the germination process. Results. During the conidia to the mycelia developmental process, the following germination rates were observed: at 24 hr, 11.7±1.2%; at 48 hr, 30±0.6%; at 72 hr, 43±1.3%; and at 96 hr, 66±2.4%. At the 96 hour stage, an EST library was constructed. It consisted of 129 sequences grouped in 4 contigs and 7 singlets for a total of 11 possible genes. Eight of the sequences had not been described previously in other EST libraries of this fungus. Conclusions. New genes were identified that were expressed during the conidia to the mycelia germination process and may represent genes specific to the germination process.

Melanina: implicaciones en la patogénesis de algunas enfermedades y su capacidad de evadir la respuesta inmune del hospedero / Melanin: implications in some disease pathogenesis and its capacity to evade the host immune response

La melanina es uno de los pigmentos más comunes y de mayor distribución en la naturaleza. Es responsable de la coloración de plantas y animales; se encuentra en los ojos, el cabello, la piel, el plumaje, la cáscara de los huevos, la cutícula de los insectos, la tinta de los cefalópodos y en la pared y el citoplasma de muchos microorganismos. En los humanos este pigmento se ha encontrado también fuera de la piel, en las neuronas de la sustancia nigra y en los hepatocitos. Entre los microorganismos que se han reportado como productores de melanina tenemos Vibrio cholerae, Mycobacterium leprae, Bacillus thurigiensis, Pseudomonas aeruginosa, Schistosoma mansoni, Fasciola gigantita Trichuris suis, Alternaria alternata, Aspergillus niger, Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Cladosporium carionii, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Exophiala (Wangiella) dermatitidis, Fonsecaea pedrosoi, Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis, Penicillium marneffei, Pneumocystis carinii (jirovecii), Scedosporium prolificans, Scytalidium dimidiatum y Sporothrix schenckii; esto sin tener en cuenta los hongos dematiáceos, entre muchos otros. Esta revisión pretende hacer un compendio de las más recientes publicaciones sobre melanina relacionadas principalmente con su función, su importante contribución a la supervivencia en el ambiente y durante la infección, como factor de virulencia en diversos microorganismos, principalmente en hongos patógenos, y su papel como agente inmunomodulador, así como la reducida susceptibilidad que confiere contra muchos de los antimicóticos usados en la actualidad.

Melanin is one of the common pigments in nature; it is responsible for pigmentation in plants and animals. It is found in skin, eyes, feathers, egg shell, hair, insect cuticle, cuttlefish ink and wall and/or cytoplasm from many microorganisms. Melanin in humans is also present in substantia nigra and hepatocytes. Some microorganisms that have been reported producing melanin are: Vibrio cholerae, Mycobacterium leprae, Bacillus thurigiensis, Pseudomonas aeruginosa, Schistosoma mansoni, Fasciola gigantita, Trichuris suis, Alternaria alternata, Aspergillus niger, Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Cladosporium carionii, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Exophiala (Wangiella) dermatitidis, Fonsecaea pedrosoi, Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis, Penicillium marneffei, Pneumocystis carinii (jirovecii), Scedosporium prolificans, Scytalidium dimidiatum, Sporothrix schenckii, and most of the dematiaceous fungi. This review is focused on recent international publications concerning melanin analysing its capacity to survive in nature and during infection inside the host and its evasion of the immune response. Melanin acts as an inmunomodulador particle and it is known that its presence in many of microorganisms could protect them from microbicidal agents presently used.

Lysozyme plays a dual role against the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis / A lisozima desempenha um papel duplo contra o fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis

In order to determine the role of lysozyme, an antimicrobial peptide belonging to the innate immune system, against the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis, co-cultures of the MH-S murine alveolar macrophages cell line with P. brasiliensis conidia were done; assays to evaluate the effect of physiological and inflammatory concentrations of lysozyme directly on the fungus life cycle were also undertaken. We observed that TNF-α-activated macrophages significantly inhibited the conidia to yeast transition (p = 0.0043) and exerted an important fungicidal effect (p = 0.0044), killing 27 percent more fungal propagules in comparison with controls. Nonetheless, after adding a selective inhibitor of lysozyme, the fungicidal effect was reverted. When P. brasiliensis propagules were exposed directly to different concentrations of lysozyme, a dual effect was observed. Physiologic concentrations of the enzyme facilitated the conidia-to-yeast transition process (p < 0.05). On the contrary, inflammatory concentrations impaired the normal temperature-dependant fungal transition (p < 0.0001). When yeast cells were exposed to lysozyme, irrespective of concentration, the multiple-budding ability was badly impaired (p < 0.0001). In addition, ultra-structural changes such as subcellular degradation, fusion of lipid vacuoles, lamellar structures and interruption of the fibrilar layer were observed in lysozyme exposed conidia. These results suggest that lysozyme appears to exert a dual role as part of the anti-P. brasiliensis defense mechanisms.

Com a finalidade de determinar o papel da lisozima, um peptídeo antimicrobiano que pertence ao sistema imune inato, contra o fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, foram feitas co-culturas de uma linha de macrófagos alveolares murinos (MH-S) com as conídias do fungo na presença ou não do TNF-α e/ou um inibidor da lisozima; também foram feitos ensaios que avaliaram o efeito das concentrações fisiológicas e inflamatórias de lisozima diretamente sobre o ciclo de vida do fungo. Observamos que os macrófagos ativados com a citoquina tiveram um efeito significativo na inibição da transição conídia/levedura (p = 0,0043) e exerceram um efeito fungicida importante (p = 0,0044), matando mais de 27 por cento das propágulas do fungo em comparação com os macrófagos não ativados. No entanto, após ser o inibidor seletivo da lisozima adicionado, o efeito fungicida foi revertido. Quando os propágulos do fungo foram expostos diretamente a diferentes concentrações da lisozima, um duplo efeito foi observado. Assim, as concentrações fisiológicas da enzima facilitaram o processo de transição conídia-levedura (p < 0,05). Contrariamente, as concentrações inflamatórias prejudicaram a transição fúngica (p < 0,0001). Quando as leveduras foram expostas a qualquer concentração de lisozima, sua capacidade de multi-brotação foi gravemente prejudicada (p < 0,0001). Além disso, mudanças ultra-estruturais, como a sub degradação, a fusão dos vacúolos dos lípidos, estruturas lamelares e interrupção da camada fibrilar foram observadas em conídios expostos à lisozima. Estes resultados sugerem que a lisozima poderia exercer um duplo papel no mecanismo antifúngico contra P. brasiliensis.

Sensibilidad a fluconazol y voriconazol de aislamientos de Candida spp., obtenidos de mucosa oral de pacientes con sida / Sensitivity to Fluconazol and Voriconazol in Candida spp. isolates from the oral mucosa of HIV positive patients

Se determinó la sensibilidad al fluconazol y al voriconazol de aislamientos de Candida spp. obtenidosde la mucosa oral de 54 pacientes con sida hospitalizadosen la ESE Hospital La María (Medellín, Colombia). además, se comprobó la especie de tales aislamientos.Los pacientes eran todos adultos (promedio de 40,5 años, rango de 23 a 56) y la mayoría (77,8 por ciento) hombres. En 40 (71,1 por ciento) de ellos se obtuvo crecimiento de Candida spp. y en 6 (11,1por ciento) se aisló más de una especie de Candida. La clasificación a especie reveló C. albicans, C. krusei, C. tropicalis, C.parapsilosis y C. glabrata. La determinación de lasensibilidad in vitro se hizo por difusión en agar con las especificaciones del CLSI de Estados Unidos (M44P). El 72,9 por ciento de los aislamientos de Candida spp. fueron sensibles al fluconazol; 6,3 por ciento, sensibles dependientes de la dosis, y 20,8 por ciento, resistentes. Para el voriconazol, 89,6 por ciento fueron sensibles; 8,3 por ciento, sensibles dependientes de la dosis y 2,1 por ciento, resistentes. La resistencia se observó en C. albicans y C. krusei. Estos resultados demuestran la efectividad de ambos antimicóticos y fue mayor la correspondiente al voriconazol. Igualmente se señala la importancia de las pruebas in vitro puesto que en pacientes con VIH/sida pueden encontrarse especies resistentes. Se ratifica la importancia de la clasificación por especiede las levaduras del género Candida.

Role of iron in the nitric oxide-mediated fungicidal mechanism of IFN-gamma-activated murine macrophages against Paracoccidioides brasiliensis conidia

Iron is an essential growth element of virtually all microorganisms and its restriction is one of the mechanisms used by macrophages to control microbial multiplication. Paracoccidioides brasiliensis, the agent of paracoccidioidomycosis, an important systemic mycosis in Latin America, is inhibited in its conidia-to-yeast conversion in the absence of iron. We studied the participation of iron in the nitric oxide (NO)-mediated fungicidal mechanism against conidia. Peritoneal murine macrophages activated with 50U/mL of IFN-gamma or treated with 35 æM Deferoxamine (DEX) and infected with P. brasiliensis conidia, were co-cultured and incubated for 96 h in the presence of different concentrations of holotransferrin (HOLO) and FeS0(4). The supernatants were withdrawn in order to assess NO2 production by the Griess method. The monolayers were fixed, stained and observed microscopically. The percentage of the conidia-to-yeast transition was estimated by counting 200 intracellular propagules. IFN-gamma-activated or DEX-treated Mthetas presented marked inhibition of the conidia-to-yeast conversion (19 and 56 percent, respectively) in comparison with non-activated or untreated Mthetas (80 percent). IFN-gamma-activated macrophages produced high NO levels in comparison with the controls. Additionally, when the activated or treated-macrophages were supplemented with iron donors (HOLO or FeSO4), the inhibitory action was reversed, although NO production remained intact. These results suggest that the NO-mediated fungicidal mechanism exerted by IFN-gamma-activated macrophages against P. brasiliensis conidia, is dependent of an iron interaction.

O ferro é elemento essencial para o crescimento de microrganismos e sua limitação é um dos mecanismos usados por macrófagos para controlar a multiplicação microbiana. Paracoccidioides brasiliensis, o agente da paracoccidioidomicose, uma das micoses sistêmicas mais importantes na América Latina, é inibido em sua conversão de conídia-à-levedura na ausência do ferro. Estudamos a participação do ferro no mecanismo fungicida mediado pelo óxido nítrico (NO) na sua interação com as conídias do fungo. Macrófagos peritoneais murinos ativados com 50U/mL de IFN-gama ou tratados com 35 æM Deferoxamina (DEX) e infectados com conídias do P. brasiliensis foram co-cultivados e incubados por 96 h na presença de concentrações diferentes de holotransferrina (HOLO) e FeS0(4). Os sobrenadantes foram retirados a fim de avaliar a produção de NO2 pelo método de Griess. Os macrófagos eram fixados, corados e observados ao microscópio. A porcentagem da transição de conídia-à-levedura foi estimada contando 200 propágulos intracelulares. Os macrófagos ativados com citocina ou tratados com DEX apresentaram inibição marcada da conversão de conídia-à-levedura (19 e 56 por cento, respectivamente) em comparação com macrófagos controle (80 por cento). Os macrófagos ativados com IFN-gama produziram elevação nos níveis de NO em comparação com macrófagos não-tratados ou não-activados. Adicionalmente, quando as monocapas ativadas ou tratadas foram suplementadas com doadores do ferro (HOLO ou FeSO4), a ação inibitória foi revertida embora a produção de NO permanecesse intacto. Estes resultados sugerem que o mecanismo fungicida mediado pelo NO exercido por macrófagos ativados com IFN-gama contra conídias do P. brasiliensis é dependente de uma interação do ferro.

Expresión de metaloproteinas y sus inhibidores de tejido en un modelo murino de fibrosis pulmonar / Metalloprotein expression and its tissue inhibitors in a murine model with pulmonary fibrosis

Antecedentes: La paracoccidioidomicosis es una micosis profunda que se caracteriza por inflamación granulomatosa crónica que progresa a fibrosis pulmonar como resultado de falta de balance entre la síntesis y degradación de la matriz extracelular, pero los mecanismos implicados no se entienden claramente. Objetivo: Determinar en un modelo murino de fibrosis pulmonar inducido por P. brasiliensis, la expresión de colagenasa intersticial (MMP-1), gelatinasa A (MMP-2) y TIMP-1. Métodos: Tejido pulmonar obtenido por biopsia de 15 ratones BALB/c infectados con P. brasiliensis y ocho inoculados con solución salina se estudiaron a las semanas 1, 4, 8, 12 y 16 post-infección. Resultados: A las 4 semanas del inúculo el 85,7% de los ratones tenían marcación para MMP-1 y MMP-2, y en el 71.4% para TIMP-1, todos de intensidad moderada en células epiteliales de los alveolos, mácrofagos alveolares y células de músculo liso alrederor de bronquíolos y vasos sanguíneos. A las 16 semanas en la gran mayoría de biopsias se observó una tinción moderada para estas metaloproteinasas, aunque de mayor intensidad en la tercera parte de las muestras; la localización de estuvo en células epiteliales y mácrofagos alveolares. Conclusión: A mayor depósito de colágeno hay mayor disbalance de las metaloproteinas y sus inhibidores de tejidos, teniendo como patrón la producción y depósito secundario a una respuesta inflamatoria. Los macrófagos alveolares y las células interticiales alveolares son las principales fuentes celulares de producción de MMP-1, MMP-2 y TIMP-1.

Background: Metalloprotein expression and its tissue inhibitors in a murine model with pulmonary fibrosis.Paracoccidioidomycosis is a deep mycosis, characterized by a chronic graulomatose inflammation. It progresses into a pulmonary fibrosis as a result of lack of balance between the synthesis and the degrading of the extracellular matrix. However, its mechanisms are not, yet, clearly understood. Objective: To determine through a P. brasiliensis induced murine model with pulmonary fibrosis, the expression of interstitial colagenase. (MMP-1), gelatinase A (MMP-2) and TIMP-1. Methods: 15 infected with P. brasiliensis and 8 control BALBB/c mice were lung biopsed 1, 4, 8, 12 y 16 postinfection. Results: 4 weeks follow inoculation 85,7% infected mice expressed MMP-1 and MMP-2, and 71.4% to TIMP-1, all with moderate intensity in alveolar macrophages, and in peribronquial and blood vessels smooth muscle cells. 16 weeks postinfection near all infected biopsies showed moderate staining to metalloproteines, but with more high intensity in 30% samples, specially in epithelial and machrophagic cells. Conclusion: To more colagen depot, thera are more metalloproteins and their tisular inhibitors, with an inflammatory pattern in production and depot. Alveolar macrophages and interstitial cells are the principal MMP-1, MMP-2 and TIMP-1 production sources.