Investigação de fatores genéticos na etiologia da síndrome do melanoma familial: copy number variations (CNV) e sequenciamento de exoma / Investigation of genetic factors on the familial melanoma syndrome etiology: copy number variations (CNV) and exome sequencing

O melanoma é um tipo raro e agressivo de câncer de pele e a maioria dos casos é esporádica. Entretanto, alguns indivíduos da população apresentam alta predisposição ao desenvolvimento de tipos específicos de câncer em decorrência da presença de mutações germinativas e/ou variantes genômicas de risco. Aproximadamente 10% dos casos de melanoma cutâneo são causados por mutações germinativas, em especial no locus CDKN2A, responsável por até 40% do melanoma familial. Outros genes com mutações germinativas altamente penetrantes já foram descritos no melanoma, como CDK4, POT1, TERT, entre outros, mas tais mutações são detectadas em pouquíssimas famílias. Portanto, a etiologia genética da maior parte da predisposição ao melanoma cutâneo permanece não determinada. O objetivo central deste trabalho foi a identificação de variantes genômicas raras associadas à suscetibilidade ao melanoma cutâneo em pacientes negativos para mutações nos principais genes conhecidos. Dois tipos de abordagens metodológicas foram empregadas: o estudo de variações do número de cópias de segmentos genômicos (Copy Number Variation - CNV) e sequenciamento de exoma. A análise de CNV foi realizada em uma casuística constituída por um grupo de 41 pacientes de melanoma cutâneo não relacionados (selecionados como melanoma familial e/ou melanomas múltiplos), sem mutações nos genes de predisposição a melanoma CDKN2A, CDK4, MITF e TERT. Identificamos 10 CNVs raras não recorrentes, distribuídas em 9 dos pacientes (22% da coorte). Todas as CNVs foram validadas pela técnica de PCR quantitativo em tempo real (qPCR) e, adicionalmente, não foram detectadas em um grupo controle de 400 indivíduos. As CNVs detectadas afetam segmentos genômicos grandes (>200 Kb), compreendendo 3 deleções (2q33.3-q34, 6p24.3 e 10q22.3) e 7 duplicações (6p22.1, 10q22.3, 12p12.3, 20p12.1, 4q26-q27, 8q23.1 e 9p24.2). Dentre os genes afetados pela mudança no número de cópias, os principais genes candidatos à predisposição ao melanoma cutâneo são IDH1, ANXA11 e ANGPT1. Na segunda parte deste trabalho, um subgrupo de cinco famílias de melanoma familial, sendo 2 membros afetados de cada família e negativos para CNVs raras foram selecionados para o sequenciamento de exoma. Selecionamos apenas variantes genômicas não-sinônimas que fossem raras na população geral (frequência < 0,01%) segundo bancos de dados populacionais e que estivessem presentes nos dois afetados da família; dessa forma, foram identificadas um total de 214 variantes genômicas raras não-sinônimas em 210 genes. Dentre essas, 63 foram consideradas danosas à função proteica, segundo algoritmos de predição. Oito variantes ocasionam perda de função protéica (LoF ­ loss-of-function). Entre os 210 genes afetados, os genes MYO7A e WRN, já foram previamente associados à predisposição ao melanoma cutâneo. Adicionalmente, o grupo de genes identificados no exoma está associado a diferentes fenótipos como melanoma (ITGA3, RECK, ADAMTS4, TYMP e MCM3), pigmentação e pele (COL4A2, HPS5, MLPH, VNN2, NID2, SLIT2 e HMCN1), além de suscetibilidade a câncer em geral (ZFHX3 e CTBP2). Em conclusão, nossos dados revelaram alterações germinativas raras em pacientes de melanoma famílial e/ou melanomas múltiplos, como CNVs e mutações potencialmente patogênicas. Este estudo, portanto, identificou novos fatores genéticos de suscetibilidade ao melanoma cutâneo na população brasileira, contribuindo com vários genes candidatos a serem explorados em futuros trabalhos.

Melanoma is a rare and aggressive kind of skin cancer and sporadic on the most cases. However, some people of the population shows high predisposition to development of specific types of cancer due germline mutations and/or genomic variants of risk. Approximately 10% of all cases of melanoma are caused by germline mutations, specially affecting the CDKN2A locus, which responds up to 40% of familial melanoma cases. Other genes harboring penetrant mutations were already described in hereditary melanoma such as CDK4, POT1, TERT, among others, but these mutations are identified in few families. Therefore, the most part of genetic etiology to cutaneous melanoma predisposition remains not elucidated. The main objective of this work was to identify rare genomic variants associated to the cutaneous melanoma susceptibility in melanoma-prone patients negative for mutations at the main genes associated to this syndrome. Two kinds of methodological approaches were applied: the assess to genomic segments of copy number variations (CNV) through high resolution SNP-arrays and exome sequencing. The cohort of hereditary melanoma was composed by 41 not-related cutaneous melanoma patients, without mutations affecting genes of melanoma predisposition CDKN2A, CDK4, MITF and TERT. We identified 10 not recurrent rare CNVs in 9 patients (22% of our cohort). All CNVs were validated using the quantitative real-time PCR (qPCR) and were not detected in a control group of 400 individuals. These CNVs affected large genomic segments (>200 Kb), comprising 3 deletions (2q33.3-q34, 6p24.3 e 10q22.3) and 7 duplications (6p22.1 10q22.3 12p12.3 20p12.1, 4q26-q27, 8q23.1 e 9p24.2). From this analysis the main candidate genes were: IDH1, ANXA11 e ANGPT1. The exome sequencing was performed in a subset of 5 melanoma-prone families; 2 members affected by melanoma from each family without rare CNVs. We selected non-synonimous genomic variants following 2 main criteria: rarity on population (frequency <0.1%) and common variants between patient and their affected relative. We identified a total of 214 nonsynonimous rare genomic variants in all families affecting 210 genes, which 63 were considered damaging to protein function according to prediction algorithms and 8 leads to loss-of-function (LoF). Between the 210 affected genes, were highlighted variants affecting the MYO7A and WRN genes which were previously associated to melanoma predispodition. Additionally, the set of genes identified by exome sequencing also showed relevance once are associated to melanoma phenotypes (ITGA3, RECK, ADAMTS4, TYMP and MCM3), skin and pigmentation (COL4A2, HPS5, MLPH, VNN2, NID2, SLIT2 and HMCN1) and cancer susceptibility (ZFHX3 and CTBP2). In conclusion, our data revealed rare germline alterations in familial and/or multiple melanomas, such as CNV and potential pathogenic mutations. Therefore, this study identified new genetic factors of susceptibility to cutaneous melanoma on the Brazilian population, contributing with a set of candidate genes to be deeply explored in further studies.

A de novo em ~1.3 Mb microdeletion at 17q11.2 associated with Neurofibromatosis-Noonan syndrome

Introduction: Neurofibromatosis-Noonan syndrome is a clinical entity considered an extended Neurofibromatosis phenotype generally caused by different types of intragenic mutations at the NF1 gene. About 5%-10% of patients with neurofibromatosis diagnosis carry chromosomal microdeletions involving NF1, often presenting with a more severe phenotype than that observedin the patients carrying intragenic mutations; however, anticipating the presence of a deletion based only in the phenotype is not straightforward. Patient and Methods: Here we investigated by oligoarray-CGH (aCGH) the presence of a submicroscopic genomic rearrangement in a patientwith a clinical picture of Neurofibromatosis, and other characteristics compatible with Noonansyndrome. Results: The aCGH analysis revealed a germline de novo ~1.3 Mb microdeletion at 17q11.2 encompassing other coding genes besides the NF1 gene. Discussion: Up to now, thenumber of reported patients with Neurofibromatosis-Noonan syndrome carrying NF1 microdeletions is quite small. The continuous identification of patients carrying 17q11.2 deletions canhelp to establish a reliable genotype-phenotype relationship in this syndrome