Curvas de fusión de regiones genómicas específicas: una herramienta prometedora para el diagnóstico y tipificación de las especies causantes de la leishmaniasis cutánea en Colombia / High-resolution melting analysis based on specific genomic regions: A promising tool for the diagnosis and typing of species causing cutaneous leishmaniasis in Colombia

Resumen Introducción. La leishmaniasis cutánea es una enfermedad causada por parásitos del género Leishmania que tiene gran incidencia en Colombia. El diagnóstico y la identificación de la especie infecciosa son factores críticos en el momento de escoger e iniciar el tratamiento. Actualmente, los métodos de diagnóstico y tipificación requieren procedimientos complejos, por lo que es necesario validar nuevos marcadores moleculares y métodos que simplifiquen el proceso. Objetivo. Desarrollar una herramienta basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con curvas de fusión (High Resolution Melting; PCR-HRM) para el diagnóstico y tipificación de las tres especies de Leishmania de importancia epidemiológica en casos de leishmaniasis cutánea en Colombia. Materiales y métodos. Los genomas de Leishmania panamensis, L. braziliensis y L. guyanensis se compararon mediante métodos bioinformáticos. Las regiones específicas de especie identificadas se validaron mediante PCR. Para los marcadores seleccionados se diseñó una PCR-HRM y se estimaron algunos parámetros de validez y seguridad usando aislamientos de pacientes colombianos caracterizados previamente mediante PCR y análisis de polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP; PCR-RFLP) del gen hsp70. Resultados. El análisis genómico comparativo mostró 24 regiones específicas de especie. Sin embargo, la validación mediante PCR solo identificó un marcador específico para cada especie de Leishmania. Los otros marcadores mostraron amplificación cruzada. El límite de detección para los tres marcadores seleccionados fue de un parásito, mientras que la sensibilidad, la especificidad, el valor predictivo positivo y el negativo fueron de 91,4, 100, 100 y 75 %, respectivamente. Conclusiones. Las tres regiones seleccionadas pueden emplearse como marcadores moleculares en el diagnóstico y tipificación de las especies causantes de la leishmaniasis cutánea en Colombia.

Abstract Introduction: Cutaneous leishmaniasis, caused by parasites of the genus Leishmania, is a disease with high incidence in Colombia. The diagnosis and identification of the infectious species are critical factors when selecting and initiating treatment. Currently, the methods for diagnosing and typing cutaneous leishmaniasis require complicated procedures and there is a need for the validation of new molecular markers and methods to simplify the process. Objective: To develop a tool based in PCR melting curves (PCR-HRM) for the diagnosis and typing of the three Leishmania species of epidemiological importance for cutaneous leishmaniasis in Colombia. Materials and methods: The genomes of Leishmania panamensis, L. braziliensis and L. guyanensis were compared with bioinformatic methods. The species-specific regions were then validated using PCR. For the selected markers, a PCR-HRM was designed, and validity and security parameters were estimated using isolates from Colombian patients previously characterized by PCR-RFLP of the hsp70 gene. Results: The comparative genomic analysis yielded 24 species-specific regions. However, the PCR validation identified only one marker that was specific to each Leishmania species. The other markers showed cross amplification. The detection limit for the three selected markers was one parasite. The sensitivity, specificity, predictive positive and negative values were 91.4%, 100%, 100% and 75%, respectively. Conclusions: The three selected regions can be used as molecular markers in the diagnosis and typing of the causative species of cutaneous leishmaniasis in Colombia.

Presencia de anticuerpos contra neurorreceptores cardiacos de acetilcolina muscarínicos tipo II en pacientes con enfermedad de Chagas e implantación de marcapasos / Presence of antibodies to cardiac neuroreceptors in patients with Chagas disease

Introducción. En diferentes tipos de afecciones cardiacas, incluida la enfermedad de Chagas, se ha descrito la presencia de anticuerpos que reconocen neurorreceptores cardiacos. La respuesta más frecuente es contra receptores de acetilcolina del tipo muscarínico subtipo II (anti-m2MAChR), que reconocen este receptor. Objetivo. El objetivo del presente estudio fue establecer la frecuencia de anticuerpos anti-m2MAChR en un grupo de pacientes cardiópatas con implantación de marcapasos y enfermedad de Chagas. Materiales y métodos. Cincuenta y dos pacientes con enfermedad de Chagas e implantación de marcapasos cardiaco fueron pareados por diagnóstico de implantación con 52 individuos con marcapaso y sin enfermedad de Chagas. La presencia de anticuerpos anti-m2MAChR fue estimada mediante ELISA e inmunoblot. Resultados. El 32,7% de los casos presentaban anticuerpos contra el segundo dominio extracelular del receptor versus 3,8% de los controles (p<0,001). El 51,9% de los casos presentaron anticuerpos contra el tercer dominio intracelular del receptor versus 19,2% de los controles (p<0,001). No se encontraron diferencias clínicas entre los pacientes que presentan y los que no presentan anticuerpos anti-m2MAChR. Conclusión. El odds ratio (OR) del presente estudio muestra una mayor probabilidad de presentar anticuerpos anti-m2MAChR en pacientes con implantación de marcapaso e infección por Trypanosoma cruzi, que en aquéllos con implantación que no presentan infección por el parásito. La presencia de anticuerpos anti-m2MAChR no está relacionada con ningún tipo de manifestación clínica de las evaluadas en este estudio.

Introduction. The presence of antibodies against cardiac neuroreceptors has been established in several kinds of heart diseases as well as in Chagas disease. The antibody type most frequently identified is that which recognizes the muscarinic acetyl choline receptor type II (anti-m2MAChR). Objective. The frequency of the anti-m2MAChR was determined in a group of Colombian patients with permanent pacemaker implantation and Chagas disease. Materials and methods. Fifty-two patients with Chagas disease and permanent heart pacemaker implantation were matched by implantation diagnosis with 52 individuals that required pacemaker, but without Chagas disease. The presence of antibodies that recognized the m2MACh was assessed in the two groups by ELISA and Western blot by using two peptide sequences of the (m2MAChR), the second extracellular domain (2e) and the third intracellular domain (3i). Results. Serological response frequency against 2e-m2MAChR in Chagas patients was 32.7% compared with 3.8% (p<0.01) in the controls; response against 3i-m2MAChR was 51.9% compared with 19.2% (p<0.01) for the controls. No clinical differences were observed between individuals that presented anti-m2MAChR and those who did not. Conclusion. The frequency of anti-m2MAChR was higher in patients with Chagas disease for two of the receptor domains. Furthermore, patients with pacemaker therapy are more likely to have anti-m2MAChR and infection by Trypanosoma cruzi. The anti-m2MAChR response is not associated with any discernable clinical manifestation in this group of patients.

Frecuencia de anticuerpos anti-Trypanosoma cruzi en pacientes portadores de marcapasos de la Clínica San Pedro Claver de Bogotá / Frequency of Trypanosoma cruzi infection in patients with implanted pacemaker

Introducción. En Colombia no se conoce cuál es el impacto de la infección por Trypanosoma cruzi en la producción de cardiopatía crónica expresada por bradiarritmias graves que requieren implante de marcapaso. Objetivo. Determinar la seroprevalencia de anticuerpos anti-Trypanosoma cruzi en pacientes con bloqueos de conducción o disfunción sinusal que requirieron implantación de marcapaso. Materiales y métodos. Mediante un estudio descriptivo de corte transversal (2004-2005) en 332 pacientes de la consulta de marcapaso de la clínica San Pedro Claver de Bogotá, se estimó la seroprevalencia de anticuerpos anti-Trypanosoma cruzi mediante las pruebas de inmunofluorescencia indirecta y ELISA. Se aplicó un formulario de recolección de datos epidemiológicos y de hallazgos de examen físico. El análisis estadístico se hizo mediante las pruebas de ji al cuadrado y T de Student. Resultados. La seroprevalencia anti-T. cruzi fue de 17,11 por ciento. Esta seropositividad se asoció con: menor edad al momento del implante del marcapaso (55,22+13,62 Vs. 59,82+17,19, p= 0,0013), con el reconocimiento de los triatominos (83,6 por ciento Vs. 39,6 por ciento, p<0,001) y con haber vivido antes de los 15 años en zonas endémicas para la enfermedad de Chagas. El paciente no conocía el diagnóstico de enfermedad de Chagas o éste no se sospechó clínicamente en el 60 por ciento de los casos. Conclusiones. La prevalencia de anticuerpos anti-T. cruzi en pacientes portadores de marcapaso es alta. La implantación de marcapasos se presentó más tempranamente en el grupo seropositivo. No hay adecuada sospecha clínica ni información al paciente sobre el diagnóstico de la enfermedad de Chagas.

Introduction. In Colombia the impact of infections of Trypanosoma cruzi are known to produce chronic cardiopathy and expressed by bradycardia. In Colombia the extent and impact of these infections has not been examined. Objective. The current study aimed to determine the prevalence of T. cruzi infection as measured by serology, in a population of patients with cardiopathy that required a permanent pacemaker as treatment for cardiac rhythm abnormalities and conduction blocking. Materials and methods. A cross sectional study sampled 332 patients from the pacemaker clinic at the San Pedro Claver Hospital in Bogotá, Colombia, for one year (2004-2005). Epidemiological and clinical data were obtained through interviews and physical examination were accomplished with chi-square and Students’ t tests. Results. Of patients with pacemakers, 17.1% had anti-T. cruzi antibodies (seropositive). At the time when the pacemaker was implanted, chronic Chagas’ disease patients were younger (55±13 years) than those patients with cardiopathy (60±17 years) with no anti-T. cruzi antibodies (p<0.01). The seropositive group was aware of the Chagas’ disease vector (83.6%) in contrast to the seronegative group (39.6%, p<0.001). In 60% of the patients of the seropositive group, no clinical signs of the disease were apparent. The geographical origin of the seropositive group were traced to regions in Colombia known to be endemic for Chagas´ disease transmission. Conclusion. Chagas´ disease prevalence is high in Colombian patients who required a permanent cardiac pacemaker. Chronic Chagas’ disease patients required pacemaker implant at a younger age in contrast with patients with other cardiac pathologies. The clinical recognition of Chagas´ disease associated with cardiopathy is low despite the epidemiological data.

Papel de la vacuola parasitófora de macrófagos de ratón infectados por Leishmania amazonensis en la adquisición de de moléculas / Role of the parasitophorous vacuole of murine macrophages infected with Leishmania amazonensis in molecule acquisition

Introducción. Leishmania son parásitos intracelulares de macrófagos, confinados en compartimentos denominados vacuolas parasitóforas. La permeabilidad de este compartimento depende de su interacción con el tráfico vesicular y transportadores presentes en su membrana. Objetivo. En este trabajo se estudió la permeabilidad de la membrana de la vacuola parasitófora en la línea celular J774.A1 infectada con Leishmania amazonensis, in situ y en compartimentos aislados. Materiales y métodos. El aislamiento de vacuolas parasitóforas se hizo por gradiente de densidad. La permeabilidad de la membrana de estas se valoró por distribución de sondas fluorescentes y electrofisiología. Para establecer indirectamente el transporte de protones se usó naranja de acridina. La presencia de transportadores ABC sensibles a probenecid se estableció con amarillo lucifer y calceína. Por primera vez con la técnica de patch-clamp se registraron corrientes en la membrana de este compartimento aislado. Resultados. La vacuola parasitófora colorea de rojo con naranja de acridina indicando un pH ácido. Concentra amarillo lucifer a través de un transportador sensible a probenecid, pero excluye la sonda calceína. Vacuolas aisladas se marcan de rojo con naranja de acridina y concentran amarillo lucifer a través de un transportador sensible a probenecid. Estas vacuolas excluyeron calceína y presentaron en su membrana una corriente iónica que se activa a diferencias de potencial cercanas a 60 mV, con una conductancia de 46 ± 3 pS. Conclusiones. Se pueden aislar vacuolas parasitóforas con propiedades de permeabilidad que preservan mecanismos de transporte similares a los encontrados in situ. Se registra por primera vez la presencia de una corriente iónica poco selectiva en la membrana de este compartimiento.

Introduction. Leishmania are intracellular parasites of macrophages, confined into compartments known as parasitophorous vacuoles. The permeability of this compartment depends on its interaction with the endocytic pathway and transport proteins present on its membrane. Objective. The membrane permeability of the parasitophorous vacuole was studied in J774.A1- macrophage like cells infected with Leishmania amazonensis, in situ and on isolated compartments. Materials and methods. The parasitophorous vacuoles were isolated by density gradients. Fluorescent probe distribution and electrophysiological recordings were used to determine parasitophorous vacuole membrane permeability. Proton transport was evaluated indirectly by acridine orange staining. Probenecid sensitive ABC transporters were detected using the fluorescent probes lucifer yellow and calcein. For the first time ion currents were recorded on the membrane of isolated parasitophorous vacuoles using the patch clamp technique. Results. The parasitophorous vacuole stains red with acridine orange indicating an acidic compartment. It concentrates lucifer yellow by means of a probenecid sensitive transporter but excludes calcein. Isolated vacuoles stained red with acridine orange and concentrated lucifer yellow by means of a probenecid sensitive transporter. These vacuoles excluded calcein and showed an ion current in their membrane which is activated at potentials close to 60 mV with a mean conductance of 46 ± 3 pS. Conclusions. Isolated parasitophorous vacuoles with permeability properties preserving transport mechanisms similar to those found in situ can be purified. A poorly selective ion current on the parasitophorous vacuole membrane is reported for the first time.

Efecto de la temperatura en la transformación de promastigotes en amastigotes de Leishmania amazonensis in vitro / Effect of the temperature in the transformation of promastigotes into amastigotes of Leishmania amazonensis in vitro

Aunque el efecto de la temperatura en la transformación axénica de Leishmania ha sido ampliamente estudiado, el papel que esta variable juega en la transformación del parásito intracelular se desconoce. El objetivo del presente trabajo fue evaluar si la transformación intracelular de promastigotes en amastigotes ocurre a bajas temperaturas. Cuando se infectaron macrófagos murinos de la línea celular J-774 a dos temperaturas diferentes (24 y 33§C), se observaron formas intracelulares de Leishmania amazonensis a las dos temperaturas. Los parásitos intracelulares producidos se compararon mediante criterios morfológicos, inmunológicos y ultraestructurales. Los resultados indican que los parásitos obtenidos en infecciones a 33§C son similares morfológica, inmunológica y ultraestructuralmente con las formas intracelulares obtenidas in vivo conocidas como amastigotes; sin embargo, los parásitos producidos a temperaturas más bajas (24§C) no tienen similitud antigénica ni ultraestructural con los anteriores. Se concluye que la temperatura cumple un papel relevante en la transformación de la forma extracelular de Leishmania amazonensis hacia la forma intracelular durante su invasión a macrófagos murinos

Malaria: fundamentos y alcances del control: características en Colombia / Malaria: foundations and reaches of the control characteristic in Colombia

e estima que el tamaño del genoma de variasespecies dePlasrnodiurn es de aproximadamente 2-4 x 1 O' pares de bases. Cerca de 10% del genomade las formas sexuales de P falciparurn estáconstituido por secuencias repetitivas (1). Lacomposición de bases del genonia dePlasrnodiurnvaría se-a ún la es~ecieE. n P falciparurn el 17-1 9%de las bases del genoma son guanina y citosina (2).Por diferentes métodos se ha estimado que Pfalciparurn tiene 14 cromoso-mas cuyo tamaño seencuentra entre 600 kb y 3.500 kb (3-7). Sin embargo,el tamaño de los cromosomas puedepresentar polimor~fismo.