Efeitos de diferentes sistemas de cultivo in vitro sobre o crescimento de folículos pré-antrais isolados de ovários de fetos bovinos / Effects of different systems of in vitro culture on the isolated preantral follicles from fetal bovine ovaries

O objetivo deste estudo foi aplicar diferentes sistemas de cultivo in vitro para folículos pré-antrais de fetos bovinos da raça Nelore no último trimestre de gestação e para identificar o sistema mais eficiente durante o crescimento dos folículos isolados. Para isso, folículos pré antrais foram isolados mecanicamente e submetidos ao cultivo individual, por 9 dias, em meio não suplementado ou suplementado com soro fetal bovino (SFB), albumina sérica bovina (BSA) ou suplemento definido sintético substituto do soro KnockoutSR(KNO). Avaliou-se ainda, o efeito do gel de colágeno ou monocamada de fibroblastos fetais bovinos como substrato para o cultivo in vitro. A avaliação do aumento de diâmetro folicular foi realizada no dia da colheita (0 hora) e a cada 72 horas de cultivo. A associação entre meio suplementado com SFB e uso de gel de colágeno como substrato foram significativamente mais efetivos sobre o aumento do diâmetro folicular quando comparados aos demais tratamentos. Quando fragmentos de tecido ovariano foram submetidos ao cultivo in vitro, não houve preservação da ultraestrutura folicular por mais de 3 dias de cultivo, em qualquer dos tratamentos utilizados. Ainda não está estabelecido um sistema de cultivo adequado que sustente a diferenciação e multiplicação das células da granulosa e que mantenha o contato das mesmas com o oócito para prover moléculas e fatores que supram a demanda metabólica. Entendemos que esta pesquisa apresentou avanços promissores na busca pelo estabelecimento um sistema de cultivo in vitro de folículos pré-antrais em bovinos.

The objective of this study is to use different in vitro culture systems of preantral follicles from Nelore breed bovine fetuses in the last gestation quarter. The evaluation of treatments considered the time of growth of isolated follicles. Preantral follicles were mechanically isolated and submitted to the individual culture, for 9 days, in mediano supplemented or supplemented with fetal calf serum (FCS), bovine serum albumin (BSA) or synthetic defined supplement substitute of serum KnockoutSR (KNO). We have also evaluated the effects of collagen gel or fetal calf fibroblast monolayer as substratum for in vitro cultures. The increase on the follicular diameter was followed in the first day (0 h), at the 72 h, 144 h and 216 h. Considering cultures of isolated follicles, the results have shown that the association between media supplemented with FCS and collagengel was significantly more efficient on the increase of the follicular diameter than other treatments. It is not still established a system ofappropriate cultivation that sustains the differentiation and multiplication of the granular cells and that maintains the contact of the same ones with the oocyte to provide molecules and factors that supply the metabolic demand. We also under stand that our results also represent another promising step on the search for the ultimate system of in vitro culture of preantral follicles from bovines.

Morfogênese do testículo de embriões e fetos de vacas da raça nelore (Bos taurus indicus) / Morfogenesis of Testis From Embryos and Fetuses of Nelore Breed Cows (Bos taurus Indicus)

Este estudo teve como objetivo acompanhar o processo de desenvolvimento testicular desde a fase indiferenciada até sua completa formação. Embriões e fetos de vacas da raça nelore (Bos taurus indicus) foram obtidos em frigoríficos próximos à cidade de Uberlândia, Minas Gerais. As gônadas dos fetos e os embriões foram fixados em bouin e processados para microscópica óptica convencional. A gônada foi observada primeiramente em um embrião de 1,0 cm de comprimento. Em embriões com 2,5 cm a presença da albugínea permite a identificação do sexo. A espessura média da albugínea variou de 29,08 a 558,46 mm. Gradativamente, observou-se aumento da vascularização da albugínea e do parênquima. O mediastino encontrava-se localizado centralmente. Houve uma diminuição no espaço ocupado pelos cordões testiculares de 63,71 para 41,99% do volume total dos testículos. O seu diâmetro variou de 31,68 a 48,80 mm. O diâmetro das células germinativas (e dos seus núcleos) foi de 12,27(6,65) a 16,95 (14,21) mm, respectivamente. A quantidade de células germinativas por corte transversal de cordão diminuiu de um máximo de 2,80 para 0,76. O número total de células germinativas foi de 16 no princípio da colonização da gônada para 18,32 x 106 no final do estudo. O número de células de Sertoli por corte transversal de cordão variou de 10,00 a 16,25. Os resultados obtidos mostram que a origem e a formação dos testículos nos embriões e fetos de vacas da raça Nelore (Bos taurus indicus) ocorre de forma muito semelhante ao do que é descrito para Bos taurus taurus.

The aim of this study was to accompany the process of testicular development from the non-differentiable phase to its complete formation. Embryos and fetuses of Nelore breed cows (Bos Taurus indicus) were obtained in slaughterhouses near the Uberlandia city, Minas Gerais. The gonads and the embryos were fixed in Bouin’s fixative and afterwards processed for conventional optical microscopy. The gonadal was observed firstly in a 1.0 cm long embryo. In 2.5 cm long embryos the presence of the albuginea allows the sex identification. The mean thickness of the albuginea ranged from 29.08 to 558.45 mm. Gradually increase of vascularization of the albuginea and parenchyma is observed. The mediastinum is located centrally. There was a decrease in the space occupied by the testicular cords, from 63.71 to 41.99% of the total testes volume. Its diameter ranged from 31.68 to 48.80 mm. The diameter of germinal cells (and their nuclei) was from 12.27 (6.65) to 16.95 914.21) mm. The quantity of germinal cells by cross section of cord decreased from a maximum of 2.80 to 0.76. The total number of germinal cells was from 16 at the beginning of colonization of the gonad to 18.32 x 106 at the end of the study. The number of Sertoli’s cells by cross section of cord ranged from 10.00 to 16.25. The results obtained show that the origin and formation of testes in embryos and fetuses from Nelore breed cows (Bos taurus indicus) does occur in a very similar way to what is described for Bos taurus taurus.

Isolamento e caracterizaçäo ultraestrutural de folículos pré-antrais de vacas da raça Nelore (Bos taurus indicus) / Isolation and ultrastructural characterization of preantral follicles in the Nelore breed cows (Bos taurus indicus)

Folículos pré-antrais de 41 vacas da raça Nelore foram quantitativa e ultraestruturalmente descritos neste estudo. Uma média de 35.539,20 folículos pré-antrais foram isolados mecanicamente ("Tissue Chopper") por animal. Os folículos foram processados para microscopia eletrônica de transmissäo. Os folículos primordiais apresentaram um oócito rodeado por uma camada de células granulosas (CGs) achatadas, com algumas tendendo à forma cuboidal. As demais fases de desenvolvimento foram classificadas como folículos primários, com uma camada de CGs cuboidais, e secundários, com mais de duas camadas de CGs cuboidais. Os folículos primordiais apresentaram oócito evidente, com núcleo excêntrico e nucléolo bem definido, cercado por regiöes de cromatina condensada. As organelas ao redor do núcleo eram, predominantemente, mitocôndrias arredondadas. Folículos em desenvolvimento apresentavam organelas mais dispersas e numerosas, com mitocôndrias alongadas. As comunicaçöes entre o oócito e as CGs mantinham-se por zonas de aderência, "coated pits" e vesículas de endocitose. A zona pelúcida (ZP) começava a aparecer em folículos primários, mostrando microvilos pequenos e vesículas penetrando na ZP. Os folículos secundários apresentavam aglomerados de grânulos corticais em associaçäo a complexos de Golgi. Concluímos que o método mecânico de isolamento fornece quantidades suficientes de folículos pré-antrais de ovários de vacas da raça Nelore e, pela semelhança ultraestrutural com os folículos de outras raças, é possível a utilizaçäo dos mesmos protocolos de cultivo que vêm sendo estudados, desde que possibilitem a maturaçäo meiótica dos oócitos

Análise ultra-estrutural de embriöes bovinos da raça Nelore / Ultra-structural analysis of Nelore embryos / Análisis ultra-estructural de embriones bovinos de la raza Nelore

O conhecimento da ultra-estrutura de embriöes bovinos, dentro das diferentes sub-espécies permite estabelecer características inerentes a cada uma delas, possibilitando o desenvolvimento de métodos eficientes para estocagem e conservaçäo desses embriöes. Diante disso,17 embriöes bovinos, da raça Nelore, foram preparados para análise ultra-estrutural, sob microscopia eletrônica. O processamento dos embriöes foi realizado no Departamento de Reproduçäo Animal da UNESP-Jaboticabal. Para tanto, os embriöes foram lavados sucessivas vezes para remoçäo do SFB, utilizado no meio de transporte, fixados em soluçäo de glutaraldeído a 1 por cento em tampäo cacodilato de sódio 0,15M e pH 7,6, desidratados em soluçöes com concentraçöes crescentes de álcool etílico, pré-incluídos, incluídos em cápsulas BEEM (Better equipment for electron microscopy), contendo resina EPON-812, submetidos em estufa à temperatura de 60§C por 72 horas, para polimerizaçäo, e seccionados. Devido às pequenas dimensöes, os embriöes inicialmente foram submetidos a secçöes semifinas(0,5µm), para que a linha de corte propiciasse visualizaçäo do trofoblasto(TF) e massa celular interna(MCI). Após a triagem dos cortes, realizaram-se secçöes ultrafinas (60-70nm), que foram colhidas em grades de cobre, coradas com acetato de uranila e citrato de chumbo e observadas ao microscópio eletrônico. Dos embriöes processados 64,71 por cento foram selecionados para análise ultra-estrutural. Observou-se que as células dos embriöes analisados apresentavam-se semelhantes às descriçöes para blastocistos de bovinos Bos taurus indicus. O trofoblasto era formado por células alongadas que constituíam duas partes distintas; o trofoblasto mural, que delimitava a blastocele, e o trofoblasto polar, que recobria as células da massa celular interna. Suas células estavam intimamente ligadas por complexos juncionais, seguidos por desmossomos. As superfícies externas dessas células eram cobertas por microvilosidades proeminentes, com filamentos axiais, enquanto suas superfícies internas apresentavam-se lisas, com junçöes comunicantes (do tipo gap) com as células da MCI. Possuíam organelas usuais como mitocôndrias, lisossomos, ribossomos e poliribossomos, retículo endoplasmático liso e rugoso e complexo de Golgi com forma e número variados. Observam-se também gotas lipídicas e numerosas vesículas. As células da MCI eram cubiformes, ligadas umas as outras por junçöes desmossômicas, apresentando coloraçäo...

Influência do folículo dominante sobre a dinâmica folicular ovariana em vacas Nelore tratadas com FSH / Influence of the dominant follicle on the ovarian follicular dynamics in Nelore cows treated with FSH

Os objetivos deste estudo foram: 1) determinar o diâmetro máximo e a taxa de crescimento do folículo dominante (FD) em vacas Nelore; 2) determinar o intervalo entre a administraçäo de PGF2µ e as manifestaçöes de estro; 3) investigar a influência da remoçäo do FD sobre o número de corpos lúteos (CL) e folículos näo ovulados (FNO) determinados por ultra-sonografia (CLus e FNOus); e 4) determinar as concentraçöes de progesterona (P4, ng/ml) e estradiol-17b (E2, pg/ml) em vacas Nelore submetidas a superovulaçäo com FSH. Após os exames ultra-sonográficos no D0 (48 horas antes do início da superovulaçäo), 42 vacas Nelore foram divididas em 3 grupos experimentais: GI (sem FD, n = 15), GII (com FD, n = 15), e GIII (com FD aspirado, n = 12). Sete dias após a primeira inseminaçäo artificial (D6), foi determinado o número de CL e FNO e colhidos os embrioes (D13). Amostras de sangue foram colhidas em D0, D2, D4 (injeçäo de PGF2µ ), D6 e D13. Os resultados permitem concluir que, embora o diâmetro máximo e a taxa de crescimento apresentados pelos FD tenham sido semelhantes aos descritos previamente em doadoras européias, na raça Nelore a açäo do FD sobre a dinâmica folicular ovariana ocorre de maneira diferente