RESUMO
BACKGROUND A number of Zika virus (ZIKV) sequences were obtained using Next-generation sequencing (NGS), a methodology widely applied in genetic diversity studies and virome discovery. However Sanger method is still a robust, affordable, rapid and specific tool to obtain valuable sequences. OBJECTIVE The aim of this study was to develop a simple and robust Sanger sequencing protocol targeting ZIKV relevant genetic regions, as envelope protein and nonstructural protein 5 (NS5). In addition, phylogenetic analysis of the ZIKV strains obtained using the present protocol and their comparison with previously published NGS sequences were also carried out. METHODS Six Vero cells isolates from serum and one urine sample were available to develop the procedure. Primer sets were designed in order to conduct a nested RT-PCR and a Sanger sequencing protocols. Bayesian analysis was used to infer phylogenetic relationships. FINDINGS Seven complete ZIKV envelope protein (1,571 kb) and six partial NS5 (0,798 Kb) were obtained using the protocol, with no amplification of NS5 gene from urine sample. Two NS5 sequences presented ambiguities at positions 495 and 196. Nucleotide analysis of a Sanger sequence and consensus sequence of previously NGS study revealed 100% identity. ZIKV strains described here clustered within the Asian lineage. MAIN CONCLUSIONS The present study provided a simple and low-cost Sanger protocol to sequence relevant genes of the ZIKV genome. The identity of Sanger generated sequences with published consensus NGS support the use of Sanger method for ZIKV population studies. The regions evaluated were able to provide robust phylogenetic signals and may be used to conduct molecular epidemiological studies and monitor viral evolution.
Assuntos
RNA Viral/genética , Genoma Viral/genética , Reação em Cadeia da Polimerase Via Transcriptase Reversa , Zika virus/genética , Filogenia , Proteínas não Estruturais Virais , Sequenciamento de Nucleotídeos em Larga EscalaRESUMO
Summary Introduction: Virus surveillance strategies and genetic characterization of human parvovirus B19 (B19V) are important tools for regional and global control of viral outbreak. In São Paulo, Brazil, we performed a study of B19V by monitoring the spread of this virus, which is an infectious agent and could be mistakenly reported as a rash and other types of infection. Method: Serum samples were subjected to enzyme immunoassay, real time polymerase chain reaction, and sequencing. Results: From the 462 patients with suspected cases of exanthematic infections, the results of the 164 serum samples were positive for B19V immunoglobulin M. Among these cases, there were 38 patients with erythema infections and B19-associated with other infections such as encephalitis, hydrops fetalis, chronic anemia, hematological malignancies. These samples were sequenced and identified as genotype 1. Conclusion: This study showed patients with infections caused by B19V and sequencing genotype 1. Continuous monitoring is necessary to detect all known genotypes, and the emergence of new genotypes of these viruses for case management in public health control activities.
Resumo Introdução: Estratégias de vigilância para o parvovírus humano B19 e caracterização genética são ferramentas importantes para o controle regional e global do surto viral. Em São Paulo, Brasil, foi realizado um estudo de parvovírus B19, monitorando a disseminação desse vírus, que é um agente infeccioso e poderia ser erroneamente relatado como uma erupção cutânea e outros tipos de infecções. Método: As amostras de soro foram submetidas ao ensaio imunoenzimático, PCR quantitativo em tempo real e sequenciamento. Resultados: Dos 462 pacientes com casos suspeitos de infecções exantemáticas, os resultados das 164 amostras de soro foram positivos para parvovírus B19 imunoglobulina M. Entre eles, 38 pacientes com eritema infeccioso apresentaram B19 associado com outras infecções, como encefalite, hidropisia fetal, anemia crônica, doenças hematológicas malignas. Essas amostras foram sequenciadas e identificadas como genótipo 1. Conclusão: Os pacientes foram infectados com parvovírus B19 e apresentaram genótipo 1. Monitoração contínua é necessária para detectar todos os genótipos conhecidos e o surgimento de novos genótipos para o controle de casos em saúde pública.
Assuntos
Humanos , Masculino , Feminino , Lactente , Pré-Escolar , Criança , Adolescente , Adulto , Adulto Jovem , Parvovirus B19 Humano/isolamento & purificação , Parvovirus B19 Humano/genética , Eritema Infeccioso/virologia , Genótipo , Brasil , DNA Viral/sangue , Imunoglobulina G/sangue , Imunoglobulina M/sangue , Imunoensaio , Hidropisia Fetal/virologia , Vigilância da População , Eritema Infeccioso/sangue , Reação em Cadeia da Polimerase Via Transcriptase Reversa , Anemia/virologia , Pessoa de Meia-Idade , Anticorpos Antivirais/sangueRESUMO
Objective: rubella during the early stages of pregnancy can lead to severe birth defects known as congenital rubella syndrome (CRS). Samples collected from pregnant women with symptoms and suspected of congenital rubella infection between 1996 and 2008 were analyzed. Methods: a total of 23 amniotic fluid samples, 16 fetal blood samples, 1 product of conception and 1 placenta were analyzed by serology and RT-PCR. Results: all patients presented positive serology for IgG / IgM antibodies to rubella virus. Among neonates, 16 were IgG-positive, 9 were IgM-positive and 4 were negative for both antibodies. Of the 25 samples analyzed in this study, 24 were positive by RT-PCR. Changes in ultrasound were found in 15 (60%) of 25 fetuses infected with rubella virus. Fetal death and miscarriage were reported in 10 (40%) of the 25 cases analyzed. The rubella virus was amplified by PCR in all fetuses with abnormal ultrasound compatible with rubella. Fetal death and abortion were reported in 10 of 25 cases analyzed. Conclusion: this study, based on primary maternal rubella infection definitely confirms the good sensitivity and specificity of RT-PCR using amniotic fluid and ultrasound. The results showed that molecular assays are important tools in the early diagnosis of rubella and congenital rubella syndrome. .
Objetivo: a rubéola, durante os primeiros estágios da gravidez, pode levar a graves defeitos congênitos, conhecidos como síndrome da rubéola congênita (SRC). Amostras de gestantes com sintomas e suspeitas da rubéola congênita foram coletadas entre 1996 e 2008. Métodos: um total de 23 amostras de fluido amniótico, 16 amostras de sangue fetal, um produto da concepção e uma placenta foram analisados por sorologia e PCR. Resultados: todas as gestantes apresentaram sorologia positiva para IgG/IgM para o vírus da rubéola. Entre os recém-nascidos, 14 apresentaram anticorpos IgG positivos e 11 foram os anticorpos IgM positivos. Das 25 amostras analisadas neste estudo, 24 eram positivas por RT-PCR. Alterações na ultrassonografia foram encontradas em 15 (60%) dos 25 fetos infectados com o vírus da rubéola. Morte fetal e aborto espontâneo foram reportados em 10 (40%) dos 25 casos analisados. O vírus da rubéola foi amplificado por PCR em todos os fetos que apresentaram alterações na ultrassonografia, compatíveis com a rubéola. Morte fetal e aborto foram relatados em 10 dos 25 casos analisados. Conclusão: os resultados mostraram que os ensaios moleculares são ferramentas importantes para o diagnóstico precoce da rubéola e da síndrome da rubéola congênita. .
Assuntos
Adolescente , Adulto , Criança , Pré-Escolar , Humanos , Lactente , Adulto Jovem , Doenças Transmissíveis Emergentes/epidemiologia , Vírus do Sarampo/genética , Sarampo/epidemiologia , Brasil/epidemiologia , Doenças Transmissíveis Emergentes/virologia , Sarampo/diagnóstico , Sarampo/virologia , Vigilância da PopulaçãoRESUMO
Human parvovirus B19 infection is known to be one of the causes of hydrops fetalis. The maternal infection caused by the virus may be symptomatic or asymptomatic. In this study, 40 pregnant women with gestational age of approximately 25 weeks, prenatal diagnosis of non immune hydrops fetalis and suspected of human parvovirus B19 infection were studied between January 1999 and December 2005. Serology results and detection of DNA in the maternal serum, foetal serum and amniotic fluid confirmed that 20 pregnant women had been infected by human parvovirus B19. The ultrasound examination demonstrated foetal hydrops, anaemia, hepatosplenomegaly, ascites, cardiopathy and amniotic fluid disorders. Among the positive cases, there were three fatal losses, one by miscarriage and two by intrauterine foetal death.
A infecção por parvovírus humano B19 é um dos responsáveis pela hidropsia fetal. A infecção materna causada pelo vírus pode ser sintomática ou assintomática. Neste estudo 40 mulheres com idade gestacional de aproximadamente 25 semanas, diagnóstico pré-natal de hidropsia fetal e suspeita de infecção por parvovírus humano B19 foram avaliadas durante o período de janeiro de 1999 a dezembro de 2005. Os resultados de sorologia e detecção de DNA no soro materno, fetal e fluido amniótico confirmaram 20 mulheres grávidas com infecção por parvovírus humano B19. A análise de ultra-som demonstrou hidropsia fetal, anemia, hepatosplenomegalia, ascite, cardiopatia e desordens amnióticas. Entre os casos positivos, ocorreram três perdas fetais: uma por aborto e duas por morte fetal intra-uterina.
Assuntos
Humanos , Feminino , Gravidez , Complicações Infecciosas na Gravidez/virologia , Hidropisia Fetal/diagnóstico , Infecções por Parvoviridae/diagnóstico , Infecções por Parvoviridae/epidemiologia , /genética , /imunologia , Análise Citogenética , Complicações Infecciosas na Gravidez/genética , Ensaio de Imunoadsorção Enzimática , Infecções por Parvoviridae/complicações , Infecções por Parvoviridae , Reação em Cadeia da Polimerase , Ultrassonografia Pré-NatalRESUMO
A partir de outubro de 2001, o Instituto Adolfo Lutz tem recebido amostras de líquido vesicular e crostas de lesões de pele de pacientes das regiões do Vale do Paraíba, Estado de São Paulo e do Vale do São Patricio, Estado de Goiás. Os dados clínicos e epidemiológicos sugeriam que os surtos poderiam ser causados por Cowpox virus ou Vaccinia virus. A maioria dos pacientes era ordenhadores que tinham lesões vesicopustulares nas mãos, braços, antebraços e alguns na face. A análise por microscopia eletrônica direta (MED) detectou partículas com morfologia de vírus do gênero Orthopoxvirus em amostras de 49 (66,21%) pacientes dos 74 analisados. Os vírus foram isolados em membrana corioalantóide (MCA) de ovo embrionado de galinha e em linhagem celular Vero com confirmação por MED e PCR. Das 21 amostras de lesões submetidas ao PCR utilizando iniciadores para o gene da hemaglutinina (HA), 19 foram positivas. A digestão por enzima de restrição TaqI resultou em quatro fragmentos característicos de Vaccinia virus. A análise nucleotídica do seqüenciamento revelou que esses vírus apresentam 99,9% de similaridade com o Cantagalo virus, descrito como uma cepa de Vaccinia virus, havendo apenas alteração de um nucleotídeo na posição 616 com mudança de um aminoácido na proteína na posição 206. A análise filogenética mostrou que os isolados se agruparam junto aos Cantagalo virus, outras cepas de Vaccinia virus e Rabbitpox virus.
Assuntos
Humanos , Animais , Masculino , Feminino , Criança , Adolescente , Adulto , Pessoa de Meia-Idade , Embrião de Galinha , Surtos de Doenças , Vacínia , Vaccinia virus , Distribuição por Idade , Sequência de Bases , Brasil , Chlorocebus aethiops , Genes Virais , Microscopia Eletrônica , Dados de Sequência Molecular , Filogenia , Reação em Cadeia da Polimerase , Polimorfismo de Fragmento de Restrição , Vaccinia virus , Células VeroRESUMO
Primary cell culture from rabbit meniscus (fibrochondrocytes-FcrC) was infected for 24 hours with different inocula (10² to 10(7) Colony Forming Units-CFU) of Mycoplasma hominis PG-21, M. pneumoniae FH and 1428 or M. arthritidis PG-6. The severity of the different obtained cytophatic effects-CPE was inoculum, Mycoplasma species and strain dependant. These bacteria were recovered from all infected FcrC and the SP4 medium for mycoplasmas also caused toxic effect on the FcrC. It was concluded that rabbit fibrochondrocytes were sensitive to mycoplasma infection, as well as to the SP4 mycoplasma medium
Assuntos
Animais , Coelhos , Artrite Infecciosa , Cartilagem , Técnicas In Vitro , Mycoplasma , Mycoplasma hominis , Infecções por Mycoplasma , Mycoplasma pneumoniae , Meios de Cultura , CoelhosRESUMO
Comparar a sensibilidade do método de difusäo em ágar e do método de extraçäo utilizando as linhagens celulares RC-IAL (células fibroblásticas de rim de coelho) e HeLa (células epiteliais de carcinoma do colo do útero humano), na avaliaçäo da citotoxidade "in vitro" de materiais de uso médico-hospitalar. Foram testadas 50 amostras escolhidas por sorteio, entre as já conhecidamente positivas e negativas e identificadas como: algodäo, espuma, borracha, latéx, celulose e acrílico. Além, das amostras citadas foram testadas experimentalmente várias concentraçöes de SDS (duodecil sulfato de sódio) nas culturas celulares RC-IAL e HeLa. Das 50 amostras testadas, 44 (88 por cento) foram positivas para os dois métodos. Mas quanto comparado o SDS nos dois métodos foram observados resultados positivos nas concentraçöes de 0,5 a 0,05 ug/ml no método de difusäo em ágar e no método de extraçäo somente foi observado efeito citotóxico até a concentraçäo de 0,25 ug/ml. Os resultados encontrados säo similares aos observados por outros autores que testaram materiais com, por exemplo, ligas metálicas. Quando foi usado o SDS observou-se, nas duas linhagens celulares, diferenças favoráveis ao método de difusäo em ágar em duas concentraçöes, isto é, a sensibilidade deste método foi significantemente maior, por inspecçäo, em relaçäo ao método de extraçäo, além de se constituir em método mais simples de ser realizado
Assuntos
Testes de Toxicidade , Técnicas de Cultura de Células , Técnicas In Vitro , Materiais Biocompatíveis , Linhagem Celular , Ágar , Equipamentos e Provisões/efeitos adversosRESUMO
Uma linhagem celular de rim de coelho (denominada RC-IAL), que foi isolada em 1976, e que atualmente está na 150ª passagem, teve suas características analisadas. As células apresentaram morfologia semelhante aos fibroblastos desde o início de seu cultivo. A proporçäo de crescimento celular näo se alterou desde seu isolamento, com uma eficiência de clonagem ao redor de 9 por cento. A linhagem mostrou crescimento dependente de ancoragem, e a análise cromossômica apresentou o número modal da espécie com pequenas variaçöes para mais ou menos um cromossomo, resultando uma somatória de 50 por cento. Sua espécie de origem foi comprovada através da reaçäo de imunofluorescência indireta e a susceptibilidade da linhagem a alguns vírus, com demonstraçäo do efeito citopático, foi verificada com os vírus da vacínia, cowpox, herpes simples tipo 1 e 2 e da rubéola. Esse substrato celular está livre de contaminantes, satisfazendo assim, as condiçöes para seu uso em trabalhos científicos, principalmente os relacionados à saúde pública