Aislamiento y caracterización de bacterias productoras de biopolimeros a partir de efluentes industriales / Isolated and characterization of biopolymer producing bacteria from industrial effluents

RESUMEN Se realizó una caracterización físico-química de los efluentes procedentes de industrias del sector educación, metalmecánico, lácteos y confitería de la ciudad de Manizales, Caldas; posteriormente se obtuvieron aislamientos, en medios diferenciales suplementados, de bacterias con potencial para la producción de biopolímeros a los cuales se les aplicó pruebas para la caracterización morfológica, bioquímica y molecular. Los parámetros físico químicos obtenidos de los efluentes industriales demuestran diferencias entre ellos, ya que cada industria genera diferentes residuos aportando una determinada contaminación al efluente, se obtuvieron 73 aislamientos productores de exopolisacáridos (EPS) y 101 productores de polihidroxialcanoatos (PHA), con características morfológicas y bioquímicas variables. El estudio muestra que los efluentes industriales son una gran fuente de bacterias de interés para la producción de diversos polímeros microbianos; principalmente aquellos que producen polímeros tipo biopoliésteres intracelulares como PHA, debido a su variabilidad físico-química y nutricional permitiendo que los microorganismos se adapten a diversas características medioambientales y de composición.

ABSTRACT A physical-chemical characterization of effluents from industries in the education, metal-mechanic, dairy and confectionery sectors of the city of Manizales, Caldas; Later isolates were obtained, in differential media supplemented, from bacteria with potential for the production of biopolymers to which they were applied tests for morphological, biochemical and molecular characterization. The physical chemical parameters obtained from the industrial effluents show a difference between them, since each industry generates different waste contributing a certain contamination to the effluent, 73 isolates producing exopolysaccharides (EPS) and 101 producers of polyhydroxyalkanoates (PHA) were obtained, with morphological characteristics and variable biochemistry. The study shows that industrial effluents are a great source of bacteria of interest for the production of various microbial polymers; mainly those that produce polymers like intracellular biopolyesters such as PHA, due to their physical-chemical and nutritional variability allowing the microorganisms to adapt to diverse environmental and compositional characteristics.

Modification and Expression of Beta-1,4-Endoglucanase encoding sequences of fungal origin in Escherichia coli BL21 / Modificación y expresión de secuencias codificantes de Beta-1,4-Endoglucanasa de origen fúngico en Escherichia coli BL21

ABSTRACT Lignocellulose is the main and most abundant component of biomass. Annually, 200 million tons are generated in the world. Colombia has a high production of lignocellulosic residues that can be used in many industrial processes such as bioethanol produc-tion, promoting the bioeconomy. The objective of the present work was to express lignocellulolytic enzymes of eukaryotic origin in Escherichia coli BL21 (DE3). Initially, endoglucanase eukaryotic genes were selected and modified using bioinformatics methods for their production in E. coli BL21 (DE3) and saccharification of pure cellulose substrates. The gene selected for its modification and expression was egl B from the fungus Aspergillus nidulans. Subsequently the enzyme integrity was tested by 3D modeling and molecular docking, as well as the conformation of its active site and its affinity for substrates of interest. Finally, cloning of the modified gene in plasmid pET151 TOPO was made and transformed in the strain E. coli BL21 (DE3) where several lignocellulose degradation tests were carried out using semiquantitative methods for the enzyme activity in carboxymethylcellulose. The presence of the three genes of interest within the plasmid pET151 TOPO and within the transformed cells of E. coli TOP10 and E. coli BL21 (DE3) was verified by colony PCRs performed. The presence of this gen was corroborated by sequencing. Expression of the modified endoglucanase enzyme was achieved in E. coli BL21 (DE3) expression cells, in soluble and functional form, demonstrated by the hydrolysis of the CMC substrate.

RESUMEN La lignocelulosa es el componente principal y más abundante de la biomasa. Anualmente se generan 200 millones de toneladas en el mundo. Colombia tiene una alta producción de residuos lignocelulósicos que pueden ser utilizados en muchos procesos industriales como la producción de bioetanol, promoviendo la bioeconomía. El objetivo del presente trabajo fue expresar enzimas lignocelulolíticas de origen eucariota en Escherichia coli BL21 (DE3). Inicialmente, los genes eucariotas de endoglucanasa se seleccionaron y modificaron mediante métodos bioinformáticos para su producción en E. coli BL21 (DE3) y la sacarificación de sustratos de celulosa. El gen seleccionado para su modificación y expresión fue eglB del hongo Aspergillus nidulans. Posteriormente se evaluó la integridad de la enzima mediante modelado 3D y acoplamiento molecular, así como la conformación de su sitio activo y su afinidad por sustratos de interés. Finalmente, se realizó la clonación del gen modificado en el plásmido pET151 TOPO y se transformó en la cepa E. coli BL21 (DE3) donde se realizaron varios ensayos de degradación de lignocelulosa utilizando métodos semicuantita-tivos para la actividad enzimática en carboximetilcelulosa. La presencia del gen de interés dentro del plásmido pET151 TOPO y dentro de las células transformadas de E. coli TOP10 y E. coli BL21 (DE3) se verificó mediante PCR de colonia. La presencia de este gene se corroboró por secuenciación eglB. La expresión de la enzima endoglucanasa modificada se logró en células de E. coli BL21 (DE3), en forma soluble y funcional, demostrada por la hidrólisis del sustrato de CMC.

Antagonism of plant growth promoting rhizobacteria against the causal agent of the vascular wilting of tomato / Antagonismo de rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal contra el agente causal de la marchitez vascular del tomate

ABSTRACT Use of biotechnological potential of native microorganisms as bio-inputs is having a great impact on agricultural systems. Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR), in addition to their beneficial effect on plant growth and on the availability of soil elements, also have an antagonistic effect against different pathogens. In this study, growth promotion mechanisms with emphasis on the antagonism of PGPR isolated from sugarcane and tomato crops were evaluated. Antagonism against Fusarium oxysporum f.sp lycopersici (Fol) was determined by dual tests, inhibition of germination and production of chitinases and endoglucanases. 52 isolates were evaluated and according to their results in dual tests 10 were selected for further analysis. Isolate GIBI127 showed the best percentage of Inhibition Germination (IG) of Fol (59.29%). Then, a selection index was calculated using results from gi, dual tests and growth promotion mechanisms to select five best isolates. Finally, these bacteria were evaluated for chitinases and endoglucanases production using Miller's method. As a result, strain GIBI419 (Burkholderia cepacia) showed a higher production of these enzymes. Selected isolates have antagonistic potential along with plant growth promotion characteristics, which can be used for the development of microbial inoculants which allow the establishment of agricultural systems for tomato cultivation that are sustainable, efficient, and environmentally friendly.

RESUMEN El uso del potencial biotecnológico de microorganismos nativos como bioinsumos está teniendo un gran impacto en los sistemas agrícolas. Las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR), además de su efecto benéfico en el crecimiento de las plantas y de facilitar la disponibilidad de elementos del suelo, también tienen un efecto antagónico frente a diferentes patógenos. En este estudio se evaluaron mecanismos de promoción del crecimiento con énfasis en el antagonismo de bacterias PGPR aisladas de cultivos de caña de azúcar y tomate. El antagonismo contra Fusarium oxysporum f.sp lycopersici (Fol) se determinó mediante pruebas duales, inhibición de la germinación y producción de quitinasas y endoglucanasas. Se evaluaron 52 aislamientos y según sus resultados en pruebas duales se seleccionaron 10 para su posterior análisis. El aislado GIBI127 mostró el mejor porcentaje de Inhibición de la Germinación (IG) de Fol (59,29%). Luego, se calculó un índice de selección utilizando los resultados de IG, pruebas duales y mecanismos de promoción del crecimiento para seleccionar los cinco mejores aislamientos. Finalmente, estas bacterias fueron evaluadas en la producción de quitinasas y endoglucanasas utilizando el método de Miller. Como resultado, se evidenció la cepa GIBI419 (Burkholderia cepacia) como la de mayor producción de estas enzimas. Los aislados seleccionados tienen un potencial antagónico junto con características de promoción del crecimiento de las plantas, que pueden usarse para el desarrollo de inoculantes microbianos que permitan el establecimiento de sistemas agrícolas para el cultivo de tomate que sean sostenibles, eficientes y amigables con el medio ambiente.

Identificación de microorganismos asociados a residuos de higuerilla (Ricinus communis) / Identification of microorganisms associated with castor (Ricinus communis) waste / Identificação de microorganismos associados resíduos de castor mamona (Ricinus communis)

El objetivo de este artículo fue aislar e identificar los microorganismos presentes en los residuos de fruto y torta de higuerilla (Ricinus communis). Se utilizaron medios de cultivo selectivos para la caracterización morfológica y bioquímica y para la identificación molecular se usó la técnica de PCR con oligonucleótidos universales RM y RB del gen 16S para bacterias y secuencias intergénicas ITS1 e ITS4 para hongos y levaduras. Las secuencias fueron analizadas identificándose nueve especies de hongos, siendo Penicillium brevicompactum predominante; 12 especies de bacterias, donde el género más recurrente fue Bacillus sp.; y dos especies de levaduras, Rhodosporidium paludigenum y Pichia burtonni. La identificación de la microbiota nativa presente en los residuos de higuerilla es muy promisoria, aportando un amplio conocimiento sobre la versatilidad metabólica de cada una de las cepas aisladas. El mayor número de aislamientos se obtuvieron de la torta por el alto contenido de nutrientes presentes en este residuo.

The aim of this article is to isolate and to identify microorganisms present in the fruit and cake waste of castor (Ricinus communis). Selective culture media for morphological and biochemical characterization were used. For molecular identification, PCR technique was performed with universal primers RM and RB from the bacterial 16S gene and the ITS5 and ITS4 intergenic sequences from molds and yeasts. Sequences were analyzed identifying 9 fungal species being predominant Penicillium brevicompactum; 12 species of bacteria, where genus Bacillus sp. was the most recurrent; and two species of yeast Pichia burtonni and Rhodosporidium paludigenum. The identification of this native microbiota in the waste of castor is very promising, providing a broad knowledge of the metabolic versatility of each of the isolates. The majority of isolates were obtained from the cake by the high content of nutrients in the waste.

O objetivo da pesquisa foi isolar e identificar os microrganismos presentes nos resíduos da fruta e bolo de mamona (Ricinus communis). Foram utilizados meios de cultura seletivos para caracterização morfológica e bioquímica. Para a identificação molecular empleou-se a técnica de PCR com primers gerais RM do gen RB 16S para bactérias e sequências intergênicas ITS1 e ITS4 para fungos e leveduras. As sequências foram analisadas e identificaram-se nove espécies de fungos, sendo o predominante Penicillium brevicompactum; 12 espécies de bactérias, nas quais o gênero mais recorrente foi o Bacillus sp.; e duas espécies de levedura Rhodosporidium paludigenum e Pichia burtonni. A identificação da microbiota nativa presente nos resíduos de rícino é muito promissoria, proporcionando um amplo conhecimento da versatilidade metabólica de cada uma das cepas isoladas. A maioria das amostras foram obtidas a partir do bolo pelo alto conteúdo de nutrientes nestos resíduos.