Light microscope observation of circulating human lymphocytes cultured in vitro

The purpose of this work was to study the isolation and a light microscopy technique for cultured lymphocytes. Blood samples were obtained by venipuncture with an anticoagulant added and centrifuged in a Percoll density gradient to separate the leukocytes. Lymphocytes were placed in 25 cm ³ tissue culture flasks at 37ºC. After culturing, they were fixed and stained with the methods used for blood smears. Results showed that not all fixing solutions and stains were an equally good choice for cultured lymphocytes.

Os linfócitos são células importantes do sistema imune e têm sido largamente utilizados em estudos morfológicos. Entretanto, a literatura sobre técnicas de preparação dessas células é escassa e antiga, especialmente para linfócitos cultivados in vitro. Portanto, o objetivo desse estudo foi relatar com detalhes as técnicas de isolamento e microscopia de luz de linfócitos mantidos em cultura. Amostras de sangue foram obtidas por punção venosa e centrifugadas em gradiente de densidade de Percoll, para separar os leucócitos. Os linfócitos foram mantidos em frascos de cultura de 25 cm³ a 37ºC. Após a cultura, as células foram fixadas e coradas de acordo com a metodologia utilizada para esfregaços sanguíneos. Nossos resultados mostraram que nem todos os fixadores e corantes utilizados para esfregaços sanguíneos são uma boa escolha para linfócitos cultivados in vitro.

Cell death induced by tamoxifen in human blood lymphocytes cultivated in vitro / Morte celular induzida pelo tamoxifeno em linfócitos humanos cultivados in vitro

Many chemotherapeutic agents with a potential against solid tumors or leukemia can cause lymphopenia. Tamoxifen (TAM) is a synthetic non-steroidal anti-estrogen drug employed in female breast cancer treatment. The present study investigated the capacity of TAM to induce cell death in human lymphocytes cultivated in vitro. Lymphocytes were obtained from young (25-30 years; n = 3) and elderly women (58-77 years; n = 3) and cultivated for 24 or 48h, with or without TAM (20 µM). After the culture, cell viability, immunocytochemical response and ultrastructure were evaluated. TAM affected lymphocytes in a time- dependent manner, and cells obtained from elderly women were the most sensitive to TAM. Immunocytochemical analysis evidenced higher frequency of apoptosis in treated cells, and the ultrastructural study revealed autophagic vacuoles, differing from the controls. In summary, the treated lymphocytes were affected by TAM, leading to cell death by apoptosis and autophagy.

Muitos agentes quimioterápicos com potencial contra tumores sólidos ou leucemias podem causar linfopenia. O Tamoxifeno (TAM) é um agente antiestrógeno não-esteroidal empregado no tratamento de câncer de mama feminino. O presente trabalho investigou a capacidade do TAM em induzir morte celular em linfócitos humanos cultivados in vitro. Os linfócitos foram obtidos de mulheres jovens (25-30 anos; n = 3) e idosas (58-77 anos; n = 3) e cultivados por 24 ou 48h, com ou sem TAM (20 µM). Após a cultura, foram analisadas a viabilidade celular, a resposta imunocitoquímica e a ultraestrutura. Os resultados indicam que o Tamoxifeno induziu morte celular em linfócitos de ambos os grupos, entretanto, as células das mulheres idosas apresentaram-se mais sensíveis ao tratamento. A análise imunocitoquímica mostrou maior frequência de apoptose nas células tratadas e o estudo ultraestrutural revelou vacúolos autofágicos nos linfócitos expostos ao Tamoxifeno. Em conclusão, nosso estudo revelou que o TAM induziu morte celular por apoptose e autofagia.

Avaliação do possível efeito tóxico de um alcano semifluorinado de uso oftalmológico sobre cultura de células Vero / Assessment of the possible toxic effect of a semifluorinated alkane on Vero cell culture

OBJETIVOS: Perfluorocarbonos líquidos (PFCLs) são usados em cirurgias oftalmológicas de vítreo-retina. Os PFCLs podem causar reações inflamatórias, danos celulares e destruição da arquitetura normal da retina. Na tentativa de se evitar estes efeitos, foram desenvolvidos os alcanos semifluorinados (ASF). Este trabalho avaliou o uso potencial de um ASF, o perfluorohexiloctano (F6H8), como substituto do vítreo de longo prazo em condições controladas por meio de cultura celular. MÉTODOS: Foi feita análise da citotoxicidade indireta, na qual as células entram em contato apenas com elementos solúveis que pudessem ser eliminados pelo perfluorohexiloctano. Avaliou-se então a toxicidade direta, ou seja, a toxicidade mediada pelo contato, do perfluorohexiloctano por meio de microscopia eletrônica de varredura e a imunocitoquímica para a actina. Utilizou-se como controle, células em meio de cultura livre de qualquer tratamento, um controle positivo para toxicidade, que apresenta comprovado efeito tóxico às células, e um controle de peso que exercesse compressão mecânica similar à quantidade de perfluorohexiloctano utilizada no experimento. RESULTADO: Observou-se que o referido produto não apresenta toxicidade indireta. Os ensaios de toxicidade direta mostraram que as alterações celulares promovidas pelo perfluorohexiloctano eram similares àquelas exercidas pelo controle de peso e distintas do controle de toxicidade. CONCLUSÕES: O perfluorohexiloctano não apresenta toxicidade indireta e tem efeito mais compressivo do que tóxico sobre as células em cultura.

The influence of nutritional stress on the diferentiation of epithelial cells in vitro

Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells have a distinctive epithelioid morphology and display several functional and anatomical properties of normal kidney tubule cells. This cell line has been cinsidered ideal for studying cell growth and regulation and for understanding the factors involved in the assembly of epithelial cells into organized multicellular units tubulogenesis. In this work, we examined the effect of nutritional stress on the morfhological and growth characteristics of MDCK cells. Control MDCK cells grew in monolayers but ceased to proliferate after confluence and eventually die. In contrast, nutritionally stressed cells showed continuous multilayered growth, with differentiation and the formation of tubular structures during prolonged culture, as well as enhanced polyploidy. Enhanced fibronectin, actin and vimentin deposition were observed in regions of cell-cell contact in stressed cells. These results indicate that nutritional stress may alter the interactions between extracellular matrix components, including fibronectin, and the cytoskeleton. Such alterations may be important in folding of the epithelial monolayer to forn tubular structures.