Nested-PCR multiplex test with increased sensitivity for detection of allogeneic cells transplanted from male to female mice / Nested-PCR multiplex com aumento da sensibilidade de detecção de células alogênicas transplantadas de camundongos machos para fêmeas

Cell therapy has shown encouraging perspectives for human and veterinary medicine. Experimentally, genetic manipulation allows to mark and locate allogeneic cells. However, this makes their genotype/phenotype different from non-marked cells used clinically. Alternatively, the presence of the Y-chromosome enables male donor cells detection in female organisms. However, the concentration of engrafted cells may be minimal in tissues, due to systemic distribution. In this study, a nested-PCR multiplex test was developed, aiming to increase the sensitivity of the presence/absence diagnosis of male mice adipose-derived (ADSC-Y) and bone marrow mononuclear (BMNC-Y) cells in samples of blood and lungs from females, after endovenous transplantation. Four females received placebos; four females received ADSC-Y from two males; and four females received BMNC-Y from two males. The PCR first-step included two primer sets (multiplex): one for amplification of a Y-chromosome fragment (SRYout; 300bp); the other for amplification of an X-chromosome (DXNds3 gene) fragment. In the PCR second-step, one primer set (SRYinn) was used for amplification of a 110bp fragment, restrained in the SRYout amplification product. The PCR internal control (DXNds3 gene) was detected in all DNA samples, whereas the SRY gene external fragment (300bp) was detected exclusively in ADSC-Y and BMNC-Y pure DNA samples. The SRY gene internal fragment (110bp) was detected in 100% of the blood and lung samples from the ADSC-Y and BMNC-Y female recipients. The nested-PCR technique increased sensitivity and reliability for molecular diagnostic of presence or absence of male mice cells in body fluids and tissues of female recipients after endovenous transplantation.

A terapia celular traz perspectivas encorajadoras à medicina humana e veterinária. Experimentalmente, a manipulação genética permite a marcação e a localização de células alogênicas. Porém, isso torna seu genótipo/fenótipo diferente daquelas usadas clinicamente, sem marcação. Alternativamente, a presença do cromossomo Y possibilita detectar células de doadores machos no organismo de fêmeas. Todavia, a concentração de células transplantadas pode ser mínima em certos tecidos, pela distribuição sistêmica. Neste estudo, foi desenvolvida uma nested-PCR multiplex, visando a aumentar a sensibilidade do diagnóstico de presença/ausência de células derivadas do tecido adiposo (CDTA-Y) e derivadas da fração mononuclear da medula óssea (CFMO-Y) de camundongos machos, em amostras de sangue e de pulmões de camundongos fêmeas, após transplante endovenoso. Quatro fêmeas receberam placebo; quatro fêmeas receberam CDTA-Y de dois machos; e quatro fêmeas receberam CFMO-Y de dois machos. A primeira fase da PCR teve dois pares de primers (multiplex): um para amplificação de fragmento do cromossomo Y (SRYout; 300pb); outro para amplificação de fragmento do cromossomo X (gene DXNds3). Na segunda fase da PCR, foi usado um par de primers para amplificação de fragmento de 110pb (SRYinn) interno ao produto amplificado pelo SRYout. O controle interno da reação (gene DXNds3) foi detectado em todas as amostras de DNA testadas, enquanto que o fragmento externo do gene SRY (300pb) foi detectado apenas nas amostras puras de DNA de CDTA-Y e CFMO-Y. O fragmento interno do gene SRY (110pb) foi detectado no sangue e nos pulmões de 100% das receptoras de CDTA-Y e CFMO-Y. A técnica de nested-PCR aumentou a sensibilidade e a segurança do diagnóstico molecular de presença ou ausência de células de camundongos machos em fluidos e tecidos de receptoras fêmeas após transplante endovenoso.

Steroidogenic enzymes mRNA expression profile and steroids production in bovine theca cells cultured in vitro and stimulated with angiotensin II / Perfil de expressão de RNAm de enzimas esteroidogênicas e produção de esteroides a partir de células da teca bovina cultivadas in vitro e estimuladas por Angiotensina II

The main objective of this study was to detect the steroidogenic effects of Ang II in bovine theca cells in vitro. Bovine theca cells were obtained from follicles (larger than 10mm of diameter) collected from a local abattoir and submitted to different treatments in a sequence of experiments. In experiment 1, CYP17A1 mRNA profile was evaluated in LH- (10ng ml-1) and Ang II-treated (0.1µM) theca cells. In experiment 2, a dose-response effect of Ang II (0.001; 0.1 e 10µM) plus insulin (100ng ml-1) and LH (100ng ml-1) was evaluated on steroidogenesis of bovine theca cells. Experiment 3 explored the effects of saralasin (an antagonist of Ang II receptors) on steroid production and steroidogenic enzymes regulation in theca cells. After 24 hours, culture media from experiments 2 and 3 was collected to evaluate testosterone and androstenedione levels by High-Performance Liquid Chromatography. In parallel, mRNA levels of key steroidogenic enzymes (HSD3B2, CYP11A1, CYP17A1) and STAR were assessed by RT-PCR. There was no difference in testosterone and androstenedione production between treated and controls groups, as well as in mRNA levels of the evaluated genes. In conclusion, the results suggest that Ang II does not regulate steroidogenesis in bovine theca cells.

O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito da Angiotensina II (Ang II) sobre a esteroidogenese nas células da teca bovina, cultivadas in vitro. Para isso, células da teca bovina foram obtidas de folículos maiores que 10 mm de diâmetro de ovários oriundos de abatedouro e submetidas a diferentes tratamentos em uma sequência de experimentos. No experimento 1, o perfil de expressão do RNAm de CYP17A1 foi avaliado nas células da teca em resposta ao LH (10ng ml-1) e/ou Ang II (0,1µM) em diferentes momentos de tratamento. No experimento 2, foi investigado o efeito dose-resposta de Ang II (0,001; 0,1 e 10µM), acrescido de insulina (100ng ml-1) e LH (100ng ̸ml) sobre a esteroidogênese nas células da teca bovina. O experimento 3 explorou os possíveis efeitos da Ang II por meio do tratamento de células da teca com saralasina (antagonista dos receptores da Ang II). Após 24 horas, nos experimentos 2 e 3, o meio de cultura foi coletado e avaliado quanto aos níveis de testosterona e androstenediona pela técnica de HPLC. Em paralelo, a expressão gênica de enzimas-chave da esteroidogênese (HSD3B2, CYP11A1, CYP17A1) e STAR foi avaliada por qRT-PCR. Não se observou diferença na produção de testosterona e androstenediona entre controle e grupos tratados, bem como, na expressão do RNAm para os genes estudados. Em conclusão, nossos resultados não demonstraram um papel da Ang II sobre a esteroidogenese nas células da teca bovina.

Genome association analysis for pregnancy status following parturition in crossbred beef cattle / Estudo de associação genômica de prenhez pós-parto em vacas de corte

The aim of this study was to evaluate genetic diversity of nine molecular markers, six short tandem repeats - STRs (BM4325, BMS3004, ILSTS002, IDVGA51, HEL5, AFZ1) and three single nucleotide polymorphisms (SNPs; LepSau3A1 A-B, LepSau3A1 1-2, and FSHRAlu1), linked to genes involved in reproductive function and their possible effect on reproductive performance. For this purpose, 81 crossbred beef cows were used in this study. The animals were classified into two groups (fertile and sub-fertile cows) based on their pregnancy status after two breeding seasons. High genetic diversity level was observed highlighted by the polymorphic content information ranging 0.23 to 0.87 and expected heterozygosity from 27 to 89%, with an average of 62%. Alleles BM4325 103, BMS3004 129, ILSTS002 137, IDVGA51 177, LEPSau3A1 A, LEPSau3A1 1, HEL5 149, AFZ1 119 and FSHRAlu1 G presented high frequencies. Two STRs (IDVGA51 and ILSTS002), linked to Leptin and LH genes, respectively, were associated to reproductive performance. These data support previous findings suggesting the potential use of IDVGA51 and ILSTS002 STRs for reproductive performance selection.

Foi avaliada a diversidade genética de nove marcadores moleculares, dos quais seis do tipo short tandem repeats - STR (BM4325, BMS3004, ILSTS002, IDVGA51, HEL5, AFZ1) e três do tipo single nucleotide polymorphisms - SNPs (LepSau3A1 A-B, LepSau3A1 1-2 e FSHRAlu1), ligados a genes envolvidos na reprodução e seus efeitos na performance reprodutiva. Foram examinadas amostras de sangue de 81 vacas sem raça definida, os animais foram classificados em dois grupos (vacas férteis e subférteis) baseado nas taxas de prenhez de duas estações reprodutivas. Alto nível de diversidade genética foi observado, revelando alto conteúdo de informação polimórfica, variando de 0,23 a 0,87 e heterozigosidade esperada de 27 a 89% com 62% em média. Os alelos mais frequentes foram BM4325 103*, BMS3004 129*, ILSTS002 137*, IDVGA51 177*, LEPSau3A1 A, LEPSau3A1 1, HEL5 149*, AFZ1 119* e FSHRAlu1 G. Os marcadores IDVGA51 e ILSTS002, ligados aos genes da leptina e LH, respectivamente, foram associados a performance reprodutiva. Esses dados suportam achados prévios que sugerem o potencial uso desses marcadores na seleção de animais com maior performance reprodutiva.