RESUMO
El fago Lambda polA (Qam 73, Sam 7) fue aislado y purificado de un lisógeno de la E. coli 594, y posteriormente se multiplicó en una cepa SupE, SupF. Se obtuvo una cantidad considerable de DNA polimerasa I multiplicándolo por vía ciclo lítico, tras la infección a alto MOI (Multiplicity of Infection) de una cepa libre de supresores amber (E. coli WK6). En este trabajo se muestran los resultados de la estandarización de las condiciones para obtener un nivel adecuado de expresión del gen polA, el esquema de purificación utilizado y se discuten las modificaciones realizadas para la obtención de la DNA polimerasa I a gran escala. La DNA pol I purificada incorporó P32-dATP por Nick translation en fragmentos de DNA entre 800-50 000 bp con un alto marcaje específico
Assuntos
Bacteriófago lambda , DNA Polimerase I/isolamento & purificação , Escherichia coliRESUMO
Se desarrolló un prototipo para la electroforesis de campo pulsante en gel de agarosa, que permite separar moléculas de ADN de hasta 2 000 kb. El equipo se fundamenta en la propiedad que tienen las moléculas grandes de ADN, de fraccionarse en geles de agarosa si son sometidas alternadamente a dos campos eléctricos no homogéneos de orientación perpendicular. En los experimentos, los tiempos de pulso fueron 60s, y se estudió la influencia de la fuerza iónica y el tiempo de corrida sobre la resolución de las bandas. El método fue utilizado para obtener el cariotipo electroforético de dos cepas de Saccharomyces cerevisiae. El trabajo describe las distintas partes del equipo, el protocolo electroforético, y la caracterización parcial de algunas bandas mediante hibridización ADN-ADN con sondas específicas para diferentes cromosomas