Differential reactivity of salivary igA and igG against streptococcus mutans proteins in humans with different caries experience

Dental caries is an infectious disease which still constitutes a public health concern. It begins at an early age and is caused mainly Streptococcus mutans (S. mutans). The aim of this study was to characterize the salivary humor immune response to S. mutans proteins in patients with caries, with history of caries and without caries, in order to determine which S. mutans proteins participate in the immunological response in subjects with different caries experience. Saliva was collected by spontaneous salivation for 5 minutes from 60 subjects aged 18 to 30 years, classified according to their caries experience as: without caries (Group I), with active caries (Group II) and with history of caries (Group III). The antigens derived from S. mutans by sonication were recognized by salivary IgA and IgG by Western Blot. The results showed that all the individuals studied recognized S. mutans proteins with molecular weights in the range of 8 to 191 kDa, with similar recognition profiles for salivary IgA and IgG. Subjects without caries recognized the 29 kDa protein, also known as S. mutans Antigen A, via salivary IgA, differing from patients with caries and history of caries, who recognized it via IgG. The protective response against S. mutans is mediated by IgA. To conclude, a differential response to the 29 kDa protein between study individuals may be indicative of resistance to dental caries and may have a protective role in the induction of IgA antibodies against dental caries, as found in the group without caries, in contrast to subjects with active caries and history of caries.

La caries dental es una enfermedad infecciosa que continua siendo un problema de salud publica, inicia a temprana edad y es causada principalmente por Streptococcus mutans (S. mutans). El objetivo de este estudio fue caracterizar la respuesta inmune humoral salival, ante las proteinas de S. mutans, en pacientes con caries, historia de caries e individuos libres de caries, para asi establecer que proteinas de S. mutans participan en la respuesta inmunologica en los diferentes estadios de caries. La saliva de 60 individuos entre 18 y 30 anos de edad, clasificados de acuerdo al estado de caries: libres de caries (grupo I), caries activa (grupo II) e historia de caries (grupo III), se colecto por salivacion espontanea durante 5 minutos. Los antigenos derivados de S. mutans por sonicacion, fueron reconocidos por IgA e IgG salivales por Western Blot. Los resultados mostraron que todos los individuos estudiados reconocen las proteinas de S. mutans en el rango de 8 a 191 kDa de peso molecular con perfiles de reconocimiento similares para IgA e IgG salival. Se encontro que los sujetos libres de caries reconocen por IgA salival la proteina de 29 kDa, tambien llamada Antigeno A de S. mutans, de manera diferente que los pacientes con caries e historia de caries quienes reconocieron la proteina via IgG. La respuesta protectora frente a S. mutans es mediada por IgA. En conclusion, una respuesta diferencial a la proteina de 29 kDa entre los individuos estudiados, puede ser indicativo de resistencia a la caries dental y tener un papel protector en la induccion de anticuerpos IgA frente a la caries dental, como se encontro en el grupo libre de caries, a diferencia de los sujetos con historia de caries y caries activa.

Odontogenic cell culture in PEGDA hydrogel scaffolds for use in tooth regeneration protocols

In order to obtain a tooth-like structure, embryonic oral ectoderm cells (EOE) and bone marrow-derived stem cells (BMSC) were stratified within a synthetic hydrogel matrix (PEGDA) and implanted in the ileal mesentery of adult male Lewis rats. Wholemount in situ hybridization was used to evaluate the expression of Pitx2, Shh and Wnt10a signals indicative of tooth initiation. In rats, expression of the three markers was present in the oral ectoderm starting at embryonic stage E12.5, which was therefore selected for cell harvesting. Embryos were obtained by controlled service of young female Lewis rats in which estrus was detected by impedance reading. At E12.5, pregnant rats were humanely euthanized and embryos were collected. The mandibular segment of the first branchial arch was dissected and the mesenchyme separated from the ectoderm by enzymatic digestion with pancreatin trypsin solution. BMSCs were collected by flushing the marrow of tibiae and femurs of adult Lewis rats with a-MEM and cultured in a-MEM in 25 cm2 flasks. Second passage BMSC's were recombined with competent oral ectoderm (E12.5-E13) stratifying them within a 3D PEGDA scaffold polymerized by exposure to UV (365nm) inside a pyramidal polypropylene mold. Constructs were incubated from 24 to 48 hrs in a-MEM and then implanted for four to six weeks in the mesentery of adult male (3- 6 month old) Lewis rats. 76 constructs were implanted (37 experimental, 27 negative controls and 12 positive controls). Upon maturation, constructs were harvested, fixed in buffered formalin, processed and stained with hematoxylin eosin (HE). Histological evaluation of the experimental and negative constructs showed that BMSCs underwent an apoptotic process due to lack of matrix interactions, known as anoikis, and were thus incapable of interacting with the competent ectoderm. In contrast, embryonic oral ectoderm was able to proliferate during the mesenteric implantation. In conclusion, PEGDA scaffolds are incompatible with BMSCs, therefore it is essential to continue the search for an ideal scaffold that allows proper tissue interactions.

Para lograr la formacion de una estructura similar a un diente se estratificaron celulas de ectodermo oral embrionario (EOE) con celulas troncales de medula osea (BMSC) dentro de una matriz de diacrilato de polietilenglicol (PEGDA) que se implanto en el mesenterio ileal de machos adultos de ratas Lewis. Mediante hibridizacion in situ de bloque completo se evaluo la expresion de tres genes iniciadores putativos de la formacion dental (Pitx2, Shh y Wnt10a), estableciendo que en ratas las senales iniciadoras de dentogenesis aparecen entre E12.5 y E13. El tejido ectodermico embrionario se obtuvo haciendo cruces controlados de hembras a las que se les detecto el estro mediante impedanciometria. En E12.5 las hembras se sacrificaron y se extrajeron los embriones. Se diseco la porcion mandibular del primer arco branquial y el ectodermo se separo del mesenquima mediante disociacion enzimatica con una solucion de pancreatina tripsina. Las BMSC se extrajeron de los huesos largos de las extremidades inferiores de ratas mediante lavado con a-MEM y se cultivaron en cajas de 25cm2 hasta un segundo pasaje. Las BMSC fueron recombinadas con ectodermo embrionario competente (E12.5 - E13) estratificandolas en un soporte tridimensional de PEGDA, polimerizado con luz ultravioleta (365nm) dentro de un molde piramidal de polipropileno (PP). Los constructos se cultivaron entre 48 y 72 horas en a-MEM y posteriormente fueron implantados en el mesenterio ileal de machos adultos (3 a 6 meses de edad) por un periodo de cuatro a seis semanas. Se implantaron 76 constructos (37 experimentales, 27 controles negativos y 12 controles positivos). En la fecha determinada los animales se sacrificaron mediante asfixia con una mezcla de CO2 y aire recuperando los constructos que se fijaron en formalina tamponada para luego procesarlos y tenirlos con hematoxilina eosina (HE). La evaluacion histologica de los constructos experimentales, positivos y negativos mostro que las BMSC incluidas en el hidrogel sufrieron un proceso de apoptosis conocido como anoikis que impidio su interaccion con las celulas ectodermicas. En contraste el EOE prolifero durante el periodo de implantacion. A futuro se debe buscar la matriz portadora ideal que permita el confinamiento de los dos grupos celulares y que brinde el soporte estructural necesario para la proliferacion de las BMSC facilitando su interaccion con las celulas inductoras de origen ectodermico.

Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries susceptible individuals

La adhesión de los microorganismos a las superficies dentales, es el paso inicial en la formación de la placa dentobacteriana, Streptococcus mutans (S. mutans) es uno de los encontrados en ésta y está asociado como el principal agente causal de una delas enfermedades más comunes en los humanos, la caries dental. La adherencia de esta bacteria se da por la interacción de adhesinas que la constituyen con los componentes salivales, específicamente con los que están formando parte de la película adquirida. La complejidad de esta interacción ha sido motivo deestudio durante los últimos años, hasta el punto de identificar algunos componentes salivales relacionados con la unión a las superficies del esmalte, tales como Proteínas ricas en prolina(PRPs), staterinas,Histatinas,Cistatinas, etc. En el presente trabajo se buscó determinar la capacidad de adhesión de S. mutans a hidroxilapatita sintética incubada con muestras de salivade personas con y sin experiencia de caries. Para estos ensayos se utilizó tanto la muestra de saliva completa como extractos de proteínas salivales, obtenidos por medio de la separaciónde las proteínas contenidas en la muestra por SDS-PAGE, en tres rangos de peso molecular seleccionados de acuerdo con el perfil electroforético que fue comúnmente encontrado. Losresultados indican que la adhesión de este microorganismo es mayor en las personas sin experiencia de caries cuando se ensayó con saliva completa y con las proteínas separadas en el rangode peso molecular de 120-159 kDa. Sugiriendo que la adhesión por sí sola no tiene un efecto determinante en los mecanismos que producen la enfermedad en algunas personas. Sin embargo estos hallazgos son interesantes ya que pueden contribuir en el diseño de estrategias para intervenir en la adhesión de S. mutanssobre las superficies dentales

Adhesion of microorganisms to dental surfaces is the initial step in the formation of dental bacterial plaque. Streptococcus mutans (S. mutans) is considered the main causal agent of one of the most common diseases in humans: dental caries. Adherence of these bacteria results from the interaction of adhesins that form part of their structure with salivary components, specifically those that compose the acquired pellicle. The complexity of this interaction has been the subject of studies in past years, to the extent of identifying certain salivary components related to adhesion to enamel surfaces, such as proline-rich proteins (PRSs), Staherins, Histatins, Cystatins, etc. One of the objectives of this study was to determine the adhesion capacity of S. mutans to synthetic hydroxyapatite incubated with saliva samples of caries-active and caries-inactive individuals. For the purpose of these assays, both the whole saliva samples and the salivary protein extracts were used. They were obtained by separating the proteins contained in the simple SDS-PAGE, in three ranges of molecular weight, selected in accordance with the electrophoresis profile that was usually found. The results indicated that the adhesion of this microorganism was greater in caries-inactive patients, when tested with whole saliva and proteins in the 120-159 kDa molecular weight range. This suggests that adhesion, per se, does not have a definite effect on the mechanisms that cause the disease in some individuals. However, these are interesting findings that may contribute to the design of strategies to control the adhesion of S. mutans to the tooth’s surface.

Adhesion of salivary components to Streptococcus mutans peptides

Streptococcus mutans es el principal microorganismo asociadoa la caries dental, esta bacteria se une al esmalte a través de su interacción con las proteínas de la película adquirida yla proteína de superficie celular comúnmente denominada PAc. Por lo menos dos sitios de PAc interactúan in vitro con los receptores salivales, uno está dentro de la región más conservadade esta proteína que comprende los residuos de 816-1213 y el otro dentro de la secuencia rica en Alanina, residuos186-469. El objetivo del presente trabajo fue establecer similitudes o diferencias en la interacción de péptidos de PAc con los componentes salivales de individuos con y sin experienciade caries, para lo cual se tomaron muestras de saliva por salivación espontánea de 20 individuos con caries y 20 sin caries. A partir de las muestras de saliva se extrajeron las proteínas de la película adquirida (PA) utilizando hidroxilapatita sintética y fueron sometidas a la interacción con trespéptidos sintéticos de los segmentos de unión de PAc con los componentes salivales: PAc (301-319), PAc (365-377) y PAc (1024-1044). Los resultados muestran una baja interacciónentre los componentes de la PA y los péptidos en todos los individuos, sugiriendo que con base en las similitudes entre los individuos sanos y los individuos con la enfermedad lospéptidos de PAc estudiados no son relevantes en la adhesión

Streptococcus mutans is the main microorganism associated to dental caries; it adheres to the dental enamel by interacting with the acquired film’s proteins and the cell surface adhesin, called variously antigen PAc. At least two distinct sites in PAc interact with salivary receptors in vitro, these are within residues 816-1213, the most conserved portion of PAc, and within residues 186-469, the alanine-rich sequence. Our purpose was to establish differences or similarities in PAc’s peptides interactions with the salivary components of individuals with and without previous caries experience. 40 saliva samples were obtained from patients with (n=20) and without (n=20) caries. The acquired film’s proteins were extracted using hydroxyapatite, and subjected to interaction with three synthetic PAc peptides (PAc (301-319), PAc (365-377), and PAc (1025-1044)) synthesized from PAc’s bonding sites to the salivary components. The results show low interaction between the acquired pellicle components and the peptides in all patients. This suggests that the examined PAc’s are not relevant as far as the initial adhesion of Streptococcus mutans to the tooth’s surface is concerned, as defined by the similarities in the results for healthy and affected individuals.