Desenvolvimento de ensaio imunofluorométrico para a medida da globulina ligadora de tiroxina (thyroxine-binding globulin, TBG) e sua aplicaçäo em casos de deficiência desta proteína / Development of an immunofluorometric assay for thyroxine-binding globulin (TBG) and its application in cases of protein deficiency

A globulina ligadora de tiroxina (thyroxine-binding globulin, TBG) é a principal transportadora de hormônios tiroidianos no soro. Variaçöes na concentraçäo sérica de TBG determinam variaçöes proporcionais nas concentraçöes séricas totais de T4 e T3, sem implicar alteraçöes de funçäo, desde que a fraçäo livre permaneça normal. Várias condiçöes clínicas comuns levam a alteraçöes significativas nos níveis de TBG, sendo as variaçöes mais importantes devidas a defeitos genéticos. Como a TBG é codificada por gene localizado no cromossomo X, os defeitos se manifestam mais facilmente no sexo masculino. Descrevemos o desenvolvimento de ensaio imunofluorométrico para a medida de TBG com base em anticorpos monoclonais, sendo um desenvolvido em nosso laboratório e outro comercial. O método apresenta sensibilidade de 0,8mg/l e coeficientes de variaçäo intra e interensaio inferiores a 10 por cento. O estudo comparativo com método comercial mostrou alta correlaçäo (r = 0,93; n = 48), sendo os valores normais obtidos de 10mg/l a 29mg/l. Estudamos também 20 indivíduos portadores de deficiência congênita de TBG, 19 homens e uma mulher, que apresentavam valores normais de TSH e baixos de T4 total; em todos eles os níveis de TBG foram indetectáveis. Já os níveis de T4 livre medidos por método indireto em 16 desses indivíduos mostraram-se elevados em todos, ao passo que, quando medidos por método direto pós-diálise nos quatro restantes, mostraram-se normais. Nossos resultados reforçam a necessidade prática da disponibilidade de ensaio para a medida de TBG para esclarecimento e definiçäo diagnóstica de alguns casos especiais, principalmente quando o ensaio de T4 livre direto, pós-diálise, näo é disponível

Produçäo de anticorpos monoclonais contra dehidroepiandrosterona (DHEA) e seuemprego no desenvolvimento de ensaios para a dosagem sérica de DHEA-sulfato (DHEA-S) / Monoclonal antiboidies against dehtdroepiandrosterone(DHEA) and their use in the development of assays for serum measurement of DHEA-sulphate (DHEA-S)

Neste trabalho, descrevemos nossa experiência na produçäo e caracterizaçäo de anticorpos monoclonais contra o sulfato de dehidroepiandrosterona (DHEA-S), sua caracterizaçäo e seu uso no desenvolvimento de radioimunoensaios tradicionais, mediante a comparaçäo dos resultados obtidos com um radioimunoensaio clássico empregando anticorpo policlonal. Foram caracterizados três anticorpos monoclonais (H6P4, B2P2 e G10p6) que apresentam coeficientes de afinidade entre 4 x 108 e 1,6 x 109 L/M e especificidades variáveis. A comparaçäo entre os valores obtidos com os três anticorpos monoclonais e aqueles obtidos com o ensaio tradicional mostrou excelente grau de correlaçäo. Os valores obtidos com o anticorpo monoclonal B2P2 apresentaram melhor índice de correlaçäo. Estudos adicionais mostraram que as características do ensaio, que empregou o anticorpo monoclonal B2P2, säo semelhantes àquelas do ensaio tradicional com anticorpo policlonal. Os anticorpos monoclonais obtidos podem servir de base para ensaios mais simples para a dosagem sérica de DHEA-S

Desenvolvimento de um ensaio imunofluorométrico para a dosagem de prolactina sérica e identificaçäo das isoformas circulantes / Development of a fluoroimmunoassay for the seric prolactin dosage and identification of circulatory isoforms

A prolactina é um peptídeo linear que na sua forma principal tem 199 aminoácidos e peso molecular de 23 kDa. Diversas isoformas circulantes foram descritas, sendo as mais significativas as de alto peso molecular ("big-big"), e as formas glicosiladas. Com o intúito de produzir anticorpos monoclonais visando o desenvolvimento de um ensaio imunométrico contra prolactina, imunizamos camundongos com prolactina humana de origem hipofisária. Os dois animais com melhores títulos foram sacrificados e os esplenócitos utilizados em duas fusöes independentes. Dez linhagens estáveis foram produzidas, sendo que duas (A12P10 e A12P3) foram empregadas no desenvolvimento de um ensaio imunofluorométrico. O ensaio apresenta uma sensibilidade de 0,4 ng/mL e o perfil de imprecisäo mostra erro inferior a 10 por cento entre 0,8 e 120 ng/mL. Os resultados obtidos com este ensaio em 384 amostras de rotina foram comparados com os obtidos com um ensaio comercial de referência (Wallac), obtendo-se uma correlaçäo de r=0,91. Soros de pacientes com prolactinoma foram cromatografados em colunas de Sephacryl S-200 e Concanavalina A Sepharose com o intúito de separar as formas de also peso molecular e as formas glicosiladas. A determinaçäo dos níveis de prolactina no eluato dessas colunas mostrou que o novo ensaio reconhece as principais isoformas circulantes de prolactina.

Estudo de um radioimunoensaio para a dosagem de testosterona sérica empregando anticorpo monoclonal / Study of a monoclonal antibody-based radioimmunoassay for serum testosterone

Apresentamos os resultados por nós obtidos na produção e uso de um anticorpo monoclonal contra testosterona. Camundongos foram imunizados com o conjugado de testosterona acomplado a partir da posição 3 com albumina bovina. As técnicas de produção foram as clássicas e um monoclonal (C7P4) foi escolhido com base em suas características de afinidade e especificidade. A comparação da especificidade deste monoclonal com um policlonal gerado contra o mesmo conjugado, em relação a um número limitado de esteróides mostrou serem os mesmos superponíveis. A aplicação do monoclonal produzido num radioimunoensaio clássico mostrou um ensaio de características de sensibilidade e erro semelhante às obtidas com o policlonal. A dosagem de 206 amostras de soro submetidas à extração etérea simples pelos dois ensaios (mono e policlonal) mostrou que o monoclonal resultou em valores significativamente mais baixos, com medianas de 58 ng/dl e 98 ng/dl, respectivamente (P<0,0001). O esudo adicional de 40 amostras de soro submetidas à extração simples e à extração seguida de cromatografia em coluna de Celite, mostrou que os resultados obtidos com o ensaio monoclonal nas amostras com extração simples eram semelhantes às obtidas com o ensaio policlonal nas mesmas amostras submetidas à extração e cromatografia (p=0,1483). Nossos dados sugerem que o monoclonal produzido pode servir de base para ensaios mais simples e específicos para a dosagem de testosterona sérica, bem como para o desenvolvimento de ensaios não-competitivos

Produçåo de anticorpos monoclonais contra alfa fetoproteína e seu emrpego no desenvolvimento de um ensaio imunofluormétrico / Production of monoclonal antibodies against alpha fetoprotein and its use in the development of an immunofluorometric assay

A alfa fetoproteína (AFP) é uma glicoproteína produzida normalmente pelo fígado fetal e saco vitelino. No adulto aumentos significativos dos valores séricos såo encontrados em alguns tipos de câncer e inflamaçöes hepáticas. Além de seu papel importante como marcador tumoral, a AFP tem tido grande importância nos programas de detecçåo pré-natal de anomalias fetais. Com base numa série de anticorpos monoclonais produzidos em nossos laboratórios contra AFP, desenvolvemos um ensaio imunofluormétrico empregado dois deles (F10P1 e C8P5). O traçador utilizado foi o Európio, sendo que o ensaio emprega placas de microtitulaçào como fase sólida, pode ser completado em 4 horas e, com alíquotas de 100 µL, a sensibilidade é da ordem de 0,01 ng/mL. O perfil de imprecisåo mostrou um erro inferior a 10//ao longo de toda curva padråo (1 a 200 ng/mL); o erro interensaio também mostrou-se inferior a 10 por cento. O estudo comparativo do método com um kit comercial tecnicamente semelhante (Delfia-AFP) mostrou excelente correlaçåo (r=0,953, n=134). O ensaio desenvolvido, com alta sensibilidade, robustez, estabilidade, rapidez e menor custo permitirá uma ampliaçöes da dosagem de AFP nos nossos serviços diagnósticos

Emprego de anticorpos monoclonais no desenvolvimento de um ensaio imunofluorométrico de alta sensibilidade para a dosagem de FSH: estudo dos níveis séricos em meninos normais nos diferentes estádios puberais / Use of monoclonal antibodies in the development of a high sensibility immunofluorometric assay to the FSH: study of the serum levels in normal boys at the pubertal stages

Produzimos sete anticorpos monoclonais contra FSH, que foram isolados e caracterizados. Dois reconhecem exclusivamente FSH, sendo que um deles (EllP3), escolhido para anticorpo de captura no desenvolvimento de um ensaio imunofluorométrico. Para marcaçao com Európio escolhemos um monoclonal anti subunidade alpha. O ensaio desenvolvido pode ser efetuado em aproximadamente 4 horas, apresenta sensibilidade em torno de OO5 UI/L e alto grau de precisao. A dosagem de 82 amostras de soro de rotina diagnóstica por este método e por um ensaio imunofluorométrico comercial, mostrou alto grau de correlaçao entre os resultados (r=0,988). Dosagens foram efetuadas também em 75 soros de meninos normais nos diferentes estadios puberais, sendo em todos êles o nível de FSH detectável, variando de O,3 a lO, l UI/L. Diferenças significativas foram observadas entre os níveis dos grupos Gl vs. G4+5 (P<0,001), Gl vs. G3 (p