Encapsulation of benznidazole in nanostructured lipid carriers and increased trypanocidal activity in a resistant Trypanosoma cruzi strain

Abstract Chagas disease is a neglected parasitic disease caused by Trypanosoma cruzi, whose treatment has remained unsatisfactory for over 50 years, given that it is limited to two drugs. Benznidazole (BZN) is an efficient antichagasic drug used as the first choice, although its poor water-solubility, irregular oral absorption, low efficacy in the chronic phase, and various associated adverse effects are limiting factors for treatment. Incorporating drugs with such characteristics into nanostructured lipid carriers (NLC) is a promising alternative to overcome these limiting obstacles, enhancing drug efficacy and bioavailability while reducing toxicity. Therefore, this study proposed NLC-BZN formulations in different compositions prepared by hot-melt homogenization followed by ultrasound, and the optimized formulation was characterized by FTIR, DRX, DSC, and thermogravimetry. Biological activities included in vitro membrane toxicity (red blood cells), fibroblast cell cytotoxicity, and trypanocidal activity against epimastigotes of the Colombian strain of T. cruzi. The optimized NLC-BZN had a small size (110 nm), negative zeta potential (-18.0 mV), and high encapsulation (1.64% of drug loading), as shown by infrared spectroscopy, X-ray diffraction, and thermal analysis. The NLC-BZN also promoted lower in vitro membrane toxicity (<3% hemolysis), and 50% cytotoxic concentration (CC50) for NLC-BZN in L929 fibroblast cells (110.7 µg/mL) was twice the value as the free BZN (51.3 µg/mL). Our findings showed that the NLC-BZN had higher trypanocidal activity than free BZN against the epimastigotes of the resistant Colombian strain, and this novel NLC-BZN formulation proved to be a promising tool in treating Chagas disease and considered suitable for oral and parenteral administration

Contamination by intestinal parasites in vegetables marketed in an area of Jequitinhonha Valley, Minas Gerais, Brazil / Contaminação por parasitas intestinais em hortaliças comercializadas em uma área do Vale do Jequitinhonha, Minas Gerais, Brasil

ABSTRACT Objective: The present study aimed to evaluate the presence of helminthes and intestinal protozoa in vegetables commercialized in Diamantina, a municipality located at Jequitinhonha Valley, one of the poorest regions of the world. Methods: A total of 108 specimens, including lettuce, green onion and rocket, were monthly collected from the most popular open street market, green grocery and supermarket of the municipality. The samples were processed by a concentration method and evaluated by light microscopy for parasitological identification. Results: The percentage of contamination was 50.9% (55/108), with predominance of nematode larvae (36.5%), cysts of Entamoeba coli (26.0%) and eggs of hookworms/Strongyloides spp. (12.9%). Lettuce showed greater contamination rate (61.1%) and samples from the open street market were more contaminated (77.8%). Information collected at each point of sale pointed the field cultivation as the critical step for such contaminations. Conclusion: Vegetables marketed in Diamantina presents a wide variety of intestinal parasites, which may represent a potential risk to the health of consumers of fresh vegetables.

RESUMO Objetivo: O presente estudo teve como objetivo avaliar a presença de helmintos e protozoários intestinais em hortaliças comercializados em Diamantina, um município localizado no Vale do Jequitinhonha, uma das regiões mais pobres do mundo. Métodos: Cento e oito exemplares, incluindo alface, cebolinha e rúcula, foram mensalmente coletados em uma feira livre, uma quitanda e um supermercado do município. As amostras foram processadas por um método de concentração e avaliadas por microscopia óptica para pesquisa de estruturas parasitárias. Resultados: O percentual global de contaminação foi de 50,9% (55/108), com predominância de larvas de nematódeos (36,5%), cistos de Entamoeba coli e ovos de ancilostomídeos/Strongyloides spp. (12,9%). A alface demonstrou a maior taxa de contaminação (61,1%) e as amostras da feira livre foram as mais contaminadas (77,8%). Informações coletadas em cada ponto de venda apontaram o cultivo em campo como a etapa crítica para a contaminação. Conclusão: Hortaliças comercializadas em Diamantina apresentam uma ampla variedade de parasitas intestinais, o que representa um risco potencial à saúde dos consumidores da área.

Spatial distribution of triatomines in domiciles of an urban area of the Brazilian Southeast Region

Reports of triatomine infestation in urban areas have increased. We analysed the spatial distribution of infestation by triatomines in the urban area of Diamantina, in the state of Minas Gerais, Brazil. Triatomines were obtained by community-based entomological surveillance. Spatial patterns of infestation were analysed by Ripley’s K function and Kernel density estimator. Normalised difference vegetation index (NDVI) and land cover derived from satellite imagery were compared between infested and uninfested areas. A total of 140 adults of four species were captured (100 Triatoma vitticeps, 25Panstrongylus geniculatus, 8 Panstrongylus megistus, and 7 Triatoma arthurneivai specimens). In total, 87.9% were captured within domiciles. Infection by trypanosomes was observed in 19.6% of 107 examined insects. The spatial distributions ofT. vitticeps, P. geniculatus, T. arthurneivai, and trypanosome-positive triatomines were clustered, occurring mainly in peripheral areas. NDVI values were statistically higher in areas infested by T. vitticeps and P. geniculatus. Buildings infested by these species were located closer to open fields, whereas infestations of P. megistus andT. arthurneivai were closer to bare soil. Human occupation and modification of natural areas may be involved in triatomine invasion, exposing the population to these vectors.

Experimental benznidazole treatment of Trypanosoma cruzi II strains isolated from children of the Jequitinhonha Valley, Minas Gerais, Brazil, with Chagas disease

Trypanosoma cruzi strains from distinct geographic areas show differences in drug resistance and association between parasites genetic and treatment response has been observed. Considering that benznidazole (BZ) can reduce the parasite burden and tissues damage, even in not cured animals and individuals, the goal is to assess the drug response to BZ of T. cruzi II strains isolated from children of the Jequitinhonha Valley, state of Minas Gerais, Brazil, before treatment. Mice infected and treated with BZ in both phases of infection were compared with the untreated and evaluated by fresh blood examination, haemoculture, polymerase chain reaction, conventional (ELISA) and non-conventional (FC-ALTA) serologies. In mice treated in the acute phase, a significant decrease in parasitaemia was observed for all strains. Positive parasitological and/or serological tests in animals treated during the acute and chronic (95.1-100%) phases showed that most of the strains were BZ resistant. However, beneficial effect was demonstrated because significant reduction (p < 0.05%) and/or suppression of parasitaemia was observed in mice infected with all strains (acute phase), associated to reduction/elimination of inflammation and fibrosis for two/eight strains. BZ offered some benefit, even in not cured animals, what suggest that BZ use may be recommended at least for recent chronic infection of the studied region.

Molecular and biological characterization of Trypanosoma cruzi strains isolated from children from Jequitinhonha Valley, State of Minas Gerais, Brazil

Introduction The biological diversity of Trypanosoma cruzi strains plays an important role in the clinical and epidemiological features of Chagas disease. Methods Eight T. cruzi strains isolated from children living in a Chagas disease vector-controlled area of Jequitinhonha Valley, State of Minas Gerais, Brazil, were genetically and biologically characterized. Results The characterizations demonstrated that all of the strains belonged to T. cruzi II, and showed high infectivity and a variable mean maximum peak of parasitemia. Six strains displayed low parasitemia, and two displayed moderate parasitemia. Later peaks of parasitemia and a predominance of intermediate and large trypomastigotes in all T. cruzi strains were observed. The mean pre-patent period was relatively short (4.2±0.25 to 13.7±3.08 days), whereas the patent period ranged from 3.3±1.08 to 34.5±3.52 days. Mortality was observed only in animals infected with strain 806 (62.5%). Histopathological analysis of the heart showed that strains 501 and 806 caused inflammation, but fibrosis was observed only in animals infected with strain 806. Conclusions The results indicate the presence of an association between the biological behavior in mice and the genetic characteristics of the parasites. The study also confirmed general data from Brazil where T. cruzi II lineage is the most prevalent in the domiciliary cycle and generally has low virulence, with some strains capable of inducing inflammatory processes and fibrosis. .

In-house ELISA method to analyze anti-Trypanosoma cruzi IgG reactivity for differential diagnosis and evaluation of Chagas disease morbidity / Método de ELISA in-house na análise da reatividade de IgG anti-Trypanosoma cruzi para o diagnóstico diferencial e avaliação da morbidade da doença de Chagas

INTRODUCTION: The goal was to develop an in-house serological method with high specificity and sensitivity for diagnosis and monitoring of Chagas disease morbidity. METHODS: With this purpose, the reactivities of anti-T. cruzi IgG and subclasses were tested in successive serum dilutions of patients from Berilo municipality, Jequitinhonha Valley, Minas Gerais, Brazil. The performance of the in-house ELISA was also evaluated in samples from other relevant infectious diseases, including HIV, hepatitis C (HCV), syphilis (SYP), visceral leishmaniasis (VL), and American tegumentary leishmaniasis (ATL), and noninfected controls (NI). Further analysis was performed to evaluate the applicability of this in-house methodology for monitoring Chagas disease morbidity into three groups of patients: indeterminate (IND), cardiac (CARD), and digestive/mixed (DIG/Mix), based on their clinical status. RESULTS: The analysis of total IgG reactivity at serum dilution 1:40 was an excellent approach to Chagas disease diagnosis (100 percent sensitivity and specificity). The analysis of IgG subclasses showed cross-reactivity, mainly with NI, VL, and ATL, at all selected serum dilutions. Based on the data analysis, the IND group displayed higher IgG3 levels and the DIG/Mix group presented higher levels of total IgG as compared with the IND and CARD groups. CONCLUSIONS: These findings demonstrated that methodology presents promising applicability in the analysis of anti-T. cruzi IgG reactivity for the differential diagnosis and evaluation of Chagas disease morbidity.

INTRODUÇÃO: O objetivo foi desenvolver um método sorológico in-house de alta especificidade e sensibilidade para diagnosticar e monitorar a morbidade da doença de Chagas. MÉTODOS: Para tal, a reatividade sorológica de IgG e subclasses foi testada em soros de pacientes chagásicos de Berilo, Vale do Jequitinhonha/MG/Brasil. A reatividade sorológica foi também avaliada em amostras de pacientes com outras doenças infecto-contagiosas relevantes, incluindo o HIV, vírus da hepatite C (VHC), sífilis (SYP), leishmaniose visceral (LV), leishmaniose tegumentar americana (LTA) e controles não infectados (NI) para verificar o desempenho do método. Outras análises foram feitas para avaliar a aplicabilidade desta metodologia no monitoramento da morbidade da doença de Chagas. Com este propósito os pacientes com doença de Chagas foram anteriormente classificados em três grupos: indeterminados (IND), cardíacos (CARD) e digestivos/mistos (DIG/Mis) conforme seu estado clínico. RESULTADOS: A análise da reatividade sorológica de IgG total na diluição 1:40 mostrou ser uma abordagem importante no diagnóstico da doença de Chagas (100 por cento de sensibilidade e especificidade e ausência de reação cruzada com as demais infecções). A análise das subclasses de IgG mostrou reação cruzada principalmente com NI, LV e LTA em todas as diluições. O grupo IND apresentou a maior reatividade para IgG3 e o grupo DIG/Mis apresentou nível mais elevado de IgG se comparados aos grupos IND e CARD. CONCLUSÕES: Estes achados demonstram que o método de ELISA in-house apresenta uma promissora aplicabilidade no diagnóstico diferencial e na avaliação da morbidade da doença de Chagas.

Tratamento com Benzonidazol em camundongos infectados com misturas de populações do Trypanosoma cruzi pertencentes aos genótipos principais / Treatment with Benznidazole in mice infected with mixtures of populations of Trypanosoma cruzi major genotypes to belonging

O objetivo desse trabalho foi avaliar o impacto de infecções mistas por clones de Trypanosoma cruzi pertencentes aos quatro genótipos principais na eficácia terapêutica do Benzonidazol (BZ) em camundongos BALB/c. Para esta proposta, foram empregados dois clones do T. cruzi de cada genótipo com diferentes níveis de virulência e de susceptibilidade ao BZ, que foram combinados aos pares totalizando 24 misturas distintas avaliadas comparativamente às respectivas monoinfecções. O tratamento com BZ reduziu os níveis de parasitemia além de outros parâmetros relacionados na maioria das infecções mistas, exceto nas da combinação dos genótipos 39+32. As taxas de mortalidade dos animais tratados (IT) e seus controles (INT) não diferiram significativamente entre as monoinfecções e as infecções mistas. A cura após tratamento foi definida empregando o critério de cura clássico, proposto por Krettli & Brener (1982) por meio de métodos parasitológicos (exame de sangue a fresco-ESF, hemocultura-Hc e PCR no sangue) e sorológicos (ELISA e pesquisa de anticorpos antitripomastigotas vivos-AATV) e, permitiu classificar os animais em tratados não curados (TNC=72,2%), tratados curados (TC=19,1) e dissociados (DIS=8,7%). Em geral, o ESF apresentou baixa positividade para a detecção da falha terapêutica (18,1%).

A Hc apresentou sensibilidade satisfatória para a maioria das infecções, exceto nos animais infectados com o genótipo 39 e com a combinação 39+32; enquanto a PCR foi o método parasitológico mais sensível, a despeito da diversidade genética do T. cruzi. Os dados demonstraram que a ELISA não deve ser utilizada em amostras coletadas antes de três meses após tratamento, uma vez que pode apresentar resultados falsos negativos. A AATV foi mais eficiente na categorização dos animais em relação à resposta terapêutica e na definição precoce de cura. Os dados do presente estudo elegem a AATV e a PCR em sangue como as técnicas mais adequadas para a definição precoce de cura após tratamento da fase aguda da infecção pelo T. cruzi no modelo murino. Um importante achado deste estudo foi a observação de resultados positivos da PCR em tecidos de animais considerados curados pelo critério clássico, sugerindo infecção residual. Uma importante questão levantada por esses resultados é se a cura parasitológica de fato existe. A avaliação dos perfis de susceptibilidade ao BZ das infecções mistas foi realizada pela comparação entre os índices de cura observado e o esperado e, revelou mudança em direção ao padrão de menor susceptibilidade ao BZ nas combinações 19+39 e 19+32. Entretanto, quando os resultados foram analisados em nível dos clones do T. cruzi, foram observadas mudanças em nove das 24 misturas tendo sido detectados tanto aumento como diminuição na susceptibilidade ao fármaco.

A caracterização molecular da amostra Cuica cl1, até então considerada um clone, demonstrou ser constituída de fato por duas populações geneticamente distintas cuja dinâmica populacional pode mudar dependendo da manutenção laboratorial. Entretanto, essas duas populações não apresentaram diferenças no perfil de susceptibilidade ao BZ. Em geral, a PCR de microssatélites apresentou boa correlação com a análise de isoenzimas na identificação dos clones presentes nas amostras isoladas de animais TNC e INT e confirmou a relação filogenética previamente determinada entre os clones por meio das análises de isoenzimas e RAPD. Apesar da análise de microssatélites apresentar baixa eficiência na identificação dos clones diretamente no sangue e nos tecidos de animais INT e TNC, os resultados obtidos dessas amostras biológicas foram similares aos obtidos para clones caracterizados após o isolamento pela Hc. Foram detectadas misturas em 7,7% dos isolados provenientes de animais INT e TNC obtidos por Hc. Em algumas misturas, resultados interessantes foram detectados revelando a presença do clone mais susceptível nas monoinfecções. Considerando a estrutura clonal do T. cruzi, um resultado inesperado foi a identificação de 15,5% dos isolados apresentando subpopulações do parasito com alelos de microssatélites distintos comparados aos clones originais. Esses achados sugerem que em alguns casos o tratamento com Benzonidazol pode resultar em um desequilíbrio da relação parasito-hospedeiro e levar ao estabelecimento de um curso da infecção distinto. Em conjunto, esses achados sugerem que infecções mistas podem apresentar um importante impacto na eficácia terapêutica. Estudos futuros são necessários para o melhor entendimento dos mecanismos envolvidos nas mudanças genéticas e no perfil de susceptibilidade ao Benzonidazol observado nas infecções mistas e o real benefício do tratamento para o hospedeiro

Tratamento com Benzonidazol em camundongos infectados com misturas de populações do Trypanosoma cruzi pertencentes aos genótipos principais

O objetivo desse trabalho foi avaliar o impacto de infecções mistas por clones de Trypanosoma cruzi pertencentes aos quatro genótipos principais na eficácia terapêutica do Benzonidazol (BZ) em camundongos BALB/c. Para esta proposta, foram empregados dois clones do T. cruzi de cada genótipo com diferentes níveis de virulência e de susceptibilidade ao BZ, que foram combinados aos pares totalizando 24 misturas distintas avaliadas comparativamente às respectivas monoinfecções. O tratamento com BZ reduziu os níveis de parasitemia além de outros parâmetros relacionados na maioria das infecções mistas, exceto nas da combinação dos genótipos 39+32. As taxas de mortalidade dos animais tratados (IT) e seus controles (INT) não diferiram significativamente entre as monoinfecções e as infecções mistas. A cura após tratamento foi definida empregando o critério de cura clássico, proposto por Krettli & Brener (1982) por meio de métodos parasitológicos (exame de sangue a fresco-ESF, hemocultura-Hc e PCR no sangue) e sorológicos (ELISA e pesquisa de anticorpos antitripomastigotas vivos-AATV) e, permitiu classificar os animais em tratados não curados (TNC=72,2%), tratados curados (TC=19,1) e dissociados (DIS=8,7%). Em geral, o ESF apresentou baixa positividade para a detecção da falha terapêutica (18,1%).

A Hc apresentou sensibilidade satisfatória para a maioria das infecções, exceto nos animais infectados com o genótipo 39 e com a combinação 39+32; enquanto a PCR foi o método parasitológico mais sensível, a despeito da diversidade genética do T. cruzi. Os dados demonstraram que a ELISA não deve ser utilizada em amostras coletadas antes de três meses após tratamento, uma vez que pode apresentar resultados falsos negativos. A AATV foi mais eficiente na categorização dos animais em relação à resposta terapêutica e na definição precoce de cura. Os dados do presente estudo elegem a AATV e a PCR em sangue como as técnicas mais adequadas para a definição precoce de cura após tratamento da fase aguda da infecção pelo T. cruzi no modelo murino. Um importante achado deste estudo foi a observação de resultados positivos da PCR em tecidos de animais considerados curados pelo critério clássico, sugerindo infecção residual. Uma importante questão levantada por esses resultados é se a cura parasitológica de fato existe. A avaliação dos perfis de susceptibilidade ao BZ das infecções mistas foi realizada pela comparação entre os índices de cura observado e o esperado e, revelou mudança em direção ao padrão de menor susceptibilidade ao BZ nas combinações 19+39 e 19+32. Entretanto, quando os resultados foram analisados em nível dos clones do T. cruzi, foram observadas mudanças em nove das 24 misturas tendo sido detectados tanto aumento como diminuição na susceptibilidade ao fármaco.

A caracterização molecular da amostra Cuica cl1, até então considerada um clone, demonstrou ser constituída de fato por duas populações geneticamente distintas cuja dinâmica populacional pode mudar dependendo da manutenção laboratorial. Entretanto, essas duas populações não apresentaram diferenças no perfil de susceptibilidade ao BZ. Em geral, a PCR de microssatélites apresentou boa correlação com a análise de isoenzimas na identificação dos clones presentes nas amostras isoladas de animais TNC e INT e confirmou a relação filogenética previamente determinada entre os clones por meio das análises de isoenzimas e RAPD. Apesar da análise de microssatélites apresentar baixa eficiência na identificação dos clones diretamente no sangue e nos tecidos de animais INT e TNC, os resultados obtidos dessas amostras biológicas foram similares aos obtidos para clones caracterizados após o isolamento pela Hc. Foram detectadas misturas em 7,7% dos isolados provenientes de animais INT e TNC obtidos por Hc. Em algumas misturas, resultados interessantes foram detectados revelando a presença do clone mais susceptível nas monoinfecções. Considerando a estrutura clonal do T. cruzi, um resultado inesperado foi a identificação de 15,5% dos isolados apresentando subpopulações do parasito com alelos de microssatélites distintos comparados aos clones originais. Esses achados sugerem que em alguns casos o tratamento com Benzonidazol pode resultar em um desequilíbrio da relação parasito-hospedeiro e levar ao estabelecimento de um curso da infecção distinto. Em conjunto, esses achados sugerem que infecções mistas podem apresentar um importante impacto na eficácia terapêutica. Estudos futuros são necessários para o melhor entendimento dos mecanismos envolvidos nas mudanças genéticas e no perfil de susceptibilidade ao Benzonidazol observado nas infecções mistas e o real benefício do tratamento para o hospedeiro