Potencial antioxidante de hidrolisados proteicos obtidos a partir de caseinato de ruminantes pela ação de proteases comerciais / Potential antioxidant of protein hydrolysates obtained from ruminant caseinate by the action of commercial proteases

Introdução: a oxidação em sistemas biológicos está relacionada ao desenvolvimento de patologias em humanos. A ingestão de alimentos ricos em compostos químicos que exercem atividade antioxidante contribui para a prevenção e redução dos efeitos deletérios dos radicais livres formados no organismo. Peptídeos derivados das caseínas têm mostrado um elevado potencial como agentes antioxidantes. Objetivos: neste sentido, o presente estudo avaliou a atividade antioxidante de hidrolisados derivados de caseínas de leites das espécies bubalina, bovina e caprina, obtidos pela ação de diferentes proteases. Metodologia: inicialmente, as caseínas foram isoladas dos demais componentes do leite, depois foram submetidas ao processo de proteólise pelas enzimas bromelina, papaína, tripsina e neutrase, individualmente. A atividade antioxidante dos hidrolisados foi avaliada, através da capacidade de eliminação dos radicais: hidroxila (OH­Ë™), superóxido (O2­Ë™), 2,2 difenil-1-picrilhidrazil (DPPH˙), 2,2'azinobis-(3-ácido etilbenzotiazolino-6-sulfônico (ABTS˙), e quelante dos íons metálicos cobre (Cu2+) e ferro (Fe2+). Resultados: os resultados mostraram que a caseína bovina apresentou o menor (35,54%) grau de hidrólise e a caseína bubalina apresentou o maior (85,64%) grau de hidrólise pela ação da neutrase e bromelina após 480 minutos, respectivamente. O potencial para o sequestro dos radicais hidroxila variou entre 0 e 100%, superóxido superior a 80%, ABTS superior a 85%, DPPH entre 20 e 95% habilidade de quelar ferro entre 10 e 100% e cobre entre 14 e 80%. Conclusão: assim, a hidrólise das caseínas do leite bubalino, bovino e caprino foram capazes de produzir hidrolisados com elevado potencial antioxidante e que, mediante novos estudos, poderá vir ser incorporado em produtos alimentícios para o consumo humano.

Introduction: oxidation in biological systems is related to the development of pathologies in humans. The ingestion of foods rich in chemical compounds that exert antioxidant activity contributes to the prevention and reduction of the deleterious effects of free radicals formed in the body. Peptides derived from caseins have shown high potential as antioxidant agents. Objectives: the present study evaluated the antioxidant activity of casein hydrolysates derived from bubaline, bovine, and caprine milk obtained by the action of different proteases. Methodology: initially, the caseins were isolated from the other milk components, and then subjected to the proteolysis process by the enzymes bromelain, papain, trypsin and neutrase, individually. The antioxidant activity of the hydrolysates was evaluated, through the capacity of elimination of the radicals: hydroxyl (OH-˙), superoxide (O2-˙), 2,2 diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH˙), 2,2'azinobis-(3-ethylbenzothiazolino-6-sulfonic acid (ABTS˙), and chelating of the metal ions copper (Cu2+) and iron (Fe2+). Results: the results showed that bovine casein showed the lowest (35.54%) degree of hydrolysis and bubaline casein showed the highest (85.64%) degree of hydrolysis by the action of neutrase and bromelin after 480 minutes, respectively. The potential for hydroxyl radical sequestration varied between 0 and 100%, superoxide higher than 80%, ABTS higher than 85%, DPPH between 20 and 95% and the ability to chelate iron between 10 and 100% and copper between 14 and 80%. Conclusion: thus, the hydrolysis of caseins from bubaline, bovine and goat milk were able to produce hydrolysates with high antioxidant potential and that, upon further studies, may be incorporated into food products for human consumption.

Antioxidant Activities of Chicken Egg White Hydrolysates Obtained by New Purified Protease of Aspergillus avenaceus URM 6706

Abstract Protein hydrolysates originating from egg white have already been reported to be bioactive and, among their biological activities, possess the antioxidant property that protects the body from early ageing and diseases linked to oxidation. Therefore, the objective of this work was to evaluate the antioxidant activity of hydrolysates obtained by the hydrolysis of egg white from hen poultry. The protease produced by Aspergillus avenaceus URM 6706 was purified and subsequently applied to hydrolysate the egg white, and the degree of hydrolysis was verified during the protease exposure time (4-24 h). The hydrolysis was intensified over time of exposure to the protease. It was possible to detect the antioxidant activities of eliminating the 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) radical (ABTS•+) from 97% to 99% and 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH•) up to 27%, as well as the chelation of Cu2+ metal ions up to 62% and Fe2+ up to 54%. The elimination of ABTS•+ radical had a positive correlation with the degree of hydrolysis; however, all the other activities tested showed a negative correlation with the degree of hydrolysis. The results obtained suggest that the egg white of hen chicken represents a food source of animal origin with potential application in the functional food industry.

Production and partial characterization of proteases from Mucor hiemalis URM3773 / Produção e caracterização parcial de proteases a partir de Mucor hiemalis URM3773

The current study evaluated the proteases production from 11 fungal species belonging to the genera Mucor, Rhizomucor and Absidia. The species were obtained from the Collection of Cultures URM at the Mycology Department-UFPE, Brazil. The best producing species was Mucor hiemalis URM 3773 (1.689 U mL-1). Plackett-Burman design methodology was employed to select the most effective parameter for protease production out of 11 medium components, including: concentration of filtrate soybean, glucose, incubation period, yeast extract, tryptone, pH, aeration, rotation, NH4Cl, MgSO4 and K2HPO4. Filtrated soybean concentration was the significant variable over the response variable, which was the specific protease activity. The crude enzyme extract showed optimal activity in pH 7.5 and at 50ºC. The enzyme was stable within a wide pH range from 5.8 to 8.0, in the phosphate buffer 0.1M and in stable temperature variation of 40-70ºC, for 180 minutes. The ions FeSO4, NaCl, MnCl2, MgCl2 and KCl stimulated the protease activity, whereas ZnCl2 ion inhibited the activity in 2.27%. Iodoacetic acid at 1mM was the proteases inhibitor that presented greater action.The results indicate that the studied enzyme have great potential for industrial application.

Foi avaliada a produção de proteases por 11 espécies fúngicas pertencentes aos gêneros Mucor, Rhizomucor e Absidia, obtidas da Coleção de Culturas URM do Departamento de Micologia- UFPE, Brasil. A melhor espécie produtora foi Mucor hiemalis URM3773 (1,689 U mL-1). A metodologia de planejamento Plackett-Burman foi empregada para selecionar o parâmetro mais efetivo para a produção de proteases através de 11 componentes do meio, incluindo: concentração do filtrado de soja, glicose, período de incubação, extrato de levedura, triptona, pH, aeração, rotação, NH4Cl, MgSO4 e K2HPO4. A variável significante sobre a variável- resposta, atividade proteásica específica, foi a concentração do filtrado de soja. O extrato enzimático bruto apresentou atividade ótima ao pH 7,5 a 50ºC. A enzima foi estável em uma ampla variação de pH de 5,8­8,0 em tampão fosfato 0,1M e termicamente estável a uma variação de 40-70°C, durante 180 minutos. Os íons FeSO4, NaCl, MnCl2, MgCl2 e KCl estimularam a atividade proteásica, enquanto que o íon ZnCl 2 inibiu 2,27% da atividade. O inibidor de proteases que teve maior ação foi o ácido iodoacético a 1mM. Os resultados obtidos indicam que a enzima estudada tem grande potencial de aplicação industrial.

Potencial do latex da fruta pão (Artocarpus altilis) como agente coagulante do leite

Breadfruit is an exotic tree in Brazil, very well acclimatized. Despite of being a laticifer plant, the knowledge about its latex is scarce. However, it is known that proteolytic enzymes represents over 50% of the latex composition in laticifers plants. The aim of this study was to evaluate the potential of breadfruit (Artocarpus altilis var. Apyrena) latex as a source of milk clotting proteases and partially characterize it. The proteolytic activity of the fraction of crude extract was assessed using azocasein and quantitation of total protein, the bicinchoninic acid (BCA). Milk-clotting activity was analyzed using skim milk at 12%. The enzyme activity was analyzed under different temperature conditions (35 to 80°C) and pH (5.8 to 10.7) presenting optimum activity in alkaline pH (8.5) and 50°C; being stable to the two variables at 120 minutes during the test. The clotting activity was directly proportional to the temperature at the better concentration of CaCl2 (10mmol L-1). The results indicate that enzyme is a possible replacement for calf rennet.

A fruta-pão é uma árvore exótica no Brasil, onde se aclimatou muito bem. Embora seja uma planta lactífera, o conhecimento sobre seu látex é escasso. No entanto, sabe-se que enzimas proteolíticas correspondem a mais de 50% da composição do látex em plantas lactíferas. O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial do látex da fruta-pão (Artocarpus altilis var. Apyrena) como fonte de protease coagulante do leite e caracterizar parcialmente a enzima. A atividade proteolítica da fração de extrato bruto foi avaliada utilizando azocaseína e, para a quantificação das proteínas totais, o ácido bicinconínico (BCA). A atividade de coagulação do leite foi testada utilizando leite desnatado a 12%. A protease foi testada em diferentes condições de temperatura (35 a 80°C) e pH (5,8 a 10,7) e apresentou atividade ótima a 50°C e pH alcalino (8,5) sendo estável a estas variáveis durante 120 minutos. A atividade coagulante no leite foi diretamente proporcional à temperatura na melhor concentração de CaCl2 a 10µmol L-1. Os resultados indicam que a enzima analisada é uma possível alternativa à quimosina.

Partial characterization of an inulinase produced by Aspergillus japonicus URM5633

Enzymes obtained by fermentation processes offer a number of advantages and have been widely researched and used throughout the world. This study aimed to partially characterise an inulinase produced from palm and cassava peel. The enzyme was produced via the solid-state fermentation of Aspergillus japonicus URM5633. The optimal temperatures were 50ºC and 55ºC, and the optimal pH values were 5.2 and 3.4 for inulinase fermentatively produced from palm and cassava peel, respectively. The thermostability measurements for inulinase produced in palm showed that the relative activity remained below 100% until 30 minutes of stability for all temperatures, but reached 106.8% at a temperature of 50ºC after 60 minutes. Inulinase from the crude extract of cassava peel was pH stable and only decreased to 55% of the maximal activity over the course of the assay, suggesting that this enzyme can be used in inulinase production and can be utilized in food industries.

Jacaratia corumbensis O. Kuntze a new vegetable source for milk-clotting enzymes

The partial characterization and purification of milk clotting enzyme obtained from the (root latex) of Jacaratia corumbensis O. kuntze was studied, by fractional precipitation with ammonium sulphate and ion exchange chromatography. The ammonium sulphate precipitate showed five fractions (AS1- 0-20 percent; AS2 - 20-40 percent; AS3 - 40-60 percent; AS4 - 60-80 percent; AS5 - 80-100 percent) and among the fractions obtained, the 40-60 percent fraction (AS3) showed the highest milk clotting activity with a purification factor of 1.2 fold in relation to the crude extract. This fraction when applied on Mono Q column yielded two protein peaks (p1 and p2), but p1 pool showed the best milk-clotting activity. The optimal pH for the crude and partially purified extract was 6.5 and 7.0, respectively. The maximum milk-clotting activity was at 55ºC for the both crude and partially purified extracts. The enzyme was inhibited by iodoacetic acid which suggested that this enzyme was a cysteine protease, with molecular weight of 33 kDa.

A enzima coagulante de leite obtida de látex de raiz de Jacaratia corumbensis O. kuntze foi caracterizada parcialmente e purificada, por precipitação fracionária com sulfato de amônio e cromatografia de troca de íon. Foram utilizadas cinco frações de sulfato de amônio (AS1 - 0-20 por cento; AS2 - 20-40 por cento; AS3 - 40-60 por cento; AS4 - 60-80 por cento; AS5 - 80-100 por cento), a fração 40-60 por cento (AS3) mostrou alta atividade coagulante com um fator de purificação de 1,2 vezes em relação ao extrato bruto. Esta fração foi aplicada em coluna Mono Q obtendo dois picos de proteína (p1 e p2), o p1 mostrou melhor atividade coagulante. O pH ótimo para o extrato bruto e parcialmente purificado foi 6,5 e 7,0, respectivamente. A atividade coagulante foi atingida a 55ºC para ambos os extratos, bruto e parcialmente purificado. A enzima foi inibida por ácido iodoacético que sugere que esta enzima é uma cisteína protease, com peso molecular de 33 kDa.

Extraction of amylase from fermentation broth in poly (Ethylene Glycol) salt aqueous two-phase system

Studies were carried out on the partition of amylase from Bacillus subtilis in a minimal medium at 37 °C and 110 rpm. Enzyme recovery was carried out in aqueous two-phase system PEG-Phosphate salt were carried out. The best purification factor (5.4) was obtained in system PEG 1000 (16.7 percent w/w) with potassium phosphate (14.8 percent w/w), at pH 6.0, resulting in a recovery of 45.2 percent activity enzymatic in the salt-rich phase.

Enzimas amilolíticas têm sido amplamente investigadas com a finalidade de melhorar os processos industriais para a degradação do amido. Foi determinado que a extração da enzima em sistema bifásico aquosos é um método aplicável para separação e purificação de biomoléculas em misturas. Vários sistemas compostos de soluções aquosas de polietilenoglicol e fosfato foram avaliados. Estudos de produção em meio mínimo suplementado, à 37°C, com uma velocidade de agitação de 110rpm e recuperação da amilase a partir do Bacillus subtilis em sistema bifásico aquoso PEG-fosfato foram avaliados. O melhor fator de purificação (5.4) foi obtido no sistema PEG 1000 (16.7 por cento w/w) com fosfato de potássio (14.8 por cento w/w), a pH 6.0, resultando na recuperação da atividade enzimática de 45.2 por cento na fase rica em sal.

Purification of plasmid (pVaxLacZ) by hydrophobic interaction chromatography

O DNA plasmidial tem sua aplicação na terapia gênica, tendo que apresentar elevado grau de pureza. Um método de purificação foi descrito neste trabalho, que inclui precipitação com sulfato de amônio seguida da cromatografia de interação hidrofóbica, usando a resina phenyl sepharose 6 fast flow. Ocorreu aumento da pureza das amostras analisadas, em torno de 30% após a precipitação com sulfato de amônio. Houve significativa redução dos contaminantes após a eluição das amostras na cromatografia de interação. O maior rendimento obtido foi 53% e fator de purificação 3,1 vezes após a eluição na cromatografia de interação hidrofóbica. A vantagem deste método é a possibilidade de explorar o caráter hidrofóbico, constituído de material genético de fita simples, tais como RNA e DNA genômico e proteínas, que podem interferir na liberação deste material para possíveis aplicações em terapia gênica.

Aspergillus niveus Blochwitz 4128URM: new source for inulinase production

Aspergillus niveus 4128URM isolado de rizosfera de girassol demonstrou ser uma nova fonte de inulinase. A enzima foi produzida em meio de cultura contendo inulina como substrato nas concentrações de 10, 15 e 20 g L-1. Atividade máxima da enzima foi obtida em meio contendo 20 g L-1 de inulina. A enzima foi parcialmente purificada utilizando precipitação com sulfato de amônio, seguida por cromatografia de troca iônica (DE-52) e exclusão molecular (Sephadex). Os resultados mostraram o pH e temperatura ótima da inulinase do extrato bruto foi 4,0 e 4,8 e 45ºC, respectivamente. A enzima foi purificada 34,65 vezes com rendimento de 53,63%. A. niveus 4128URM pode ser utilizado na produção de inulinase com perspectivas de uso na indústria de alimentos.

Recovery of ascorbic oxidoreductase from crude extract with an aqueous two-phase system in a perforated rotating disc contactor

Uma coluna de discos perfurados rotativos foi utilizada na extração da enzima ascorbato oxidorredutase (E.C.1.10.3.3), obtida do extrato bruto de Curcubita maxima, através da utilização do sistema bifásico aquoso Polietilenoglicol-sais de fosfato. Os efeitos da velocidade da fase dispersa nos coeficientes de transferência de massa e na eficiência de separação para valores de 1, 2 e 3 mL/min foram estudados. Observou-se um aumento da transferência de massa com a velocidade da fase dispersa, enquanto que a eficiência de separação demonstrou uma ligeira redução com o aumento deste parâmetro. Os resultados experimentais obtidos durante a extração contínua demonstraram que a atividade da ascorbato oxidorredutase se concentrou preferencialmente na fase rica em sal para todas as condições estudadas. A maior recuperação da atividade enzimática foi de 236%, com um fator de purificação de 34 para o valor de 1 mL/min para a fase dispersa.

Partial characterization of proteases from Spretomyces clavuligerus using an inexpensive medium

The partial characterization of extracellular proteases from Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 and 644 mutant was investigated. The enzyme production was carried out in batch fermentation using soy bean filtrate as nitrogen source. Maximum activity was obtained after 96h of fermentation with an initial pH of 7.0. The enzyme was partially purified by ammonium sulphate precipitation. Enzymes from the two strains retained 37 per cent of their initial activities at pH 8.0 after 2 h incubation at 25§C. Enzyme half-life at pH 8.0 and 60§C was 40.30 and 53.32 min, respectively for both strains (partially purified extract). The optimum pH was obtained at pH 7.0-8.0 and 8.4 for enzymes produced for 3585 and 644 strains (crude extract), respectively, and 8.4 and 8.0 for enzymes from the partially purified extract 3585 and 644 strains, respectively. The optimum temperature for the crude extract was 21§C for both strains. However, for the partially preparation the optimum temperature was 50§C and 40ºC for S. clavuligerus NRRL 3585 and 644 strains respectively.