Repair of bone defects using adipose-derived stem cells combined with alpha-tricalcium phosphate and gelatin sponge scaffolds in a rat model

Abstract Objectives This study aimed to evaluate the potential of adipose-derived stem cells (ASCs) combined with a modified α-tricalcium phosphate (α-TCP) or gelatin sponge (GS) scaffolds for bone healing in a rat model. Material and Methods Bone defects were surgically created in the femur of adult SHR rats and filled with the scaffolds, empty or combined with ASCs. The results were analyzed by histology and histomorphometry on days seven, 14, 30, and 60. Results Significantly increased bone repair was observed on days seven and 60 in animals treated with α-TCP/ASCs, and on day 14 in the group treated with GS/ASCs, when compared with the groups treated with the biomaterials alone. Intense fibroplasia was observed in the group treated with GS alone, on days 14 and 30. Conclusions Our results showed that the use of ASCs combined with α-TCP or GS scaffolds resulted in increased bone repair. The higher efficacy of the α-TCP scaffold suggests osteoconductive property that results in a biological support to the cells, whereas the GS scaffold functions just as a carrier. These results confirm the potential of ASCs in accelerating bone repair in in vivo experimental rat models. These results suggest a new alternative for treating bone defects.

Association of mesenchymal stem cells with platelet rich plasma on the repair of critical calvarial defects in mice / Associação de células-tronco mesenquimais com plasma rico em plaquetas na reparação de defeitos críticos em calvária de camundongos

PURPOSE: To evaluate the effects of mesenchymal stem cells (MSC) from eight mice C57BL/6 gfp+ bone marrows expanded in cultures associated with platelets rich plasma (PRP) deriving from another eight mice, in the repair of critical defects in calvarial bone produced in twenty-four adult isogenic mice C57BL/6. METHODS: The animals were submitted to a cranial defect of 6.0mm in diameter and divided into two equal experimental groups. Control group did not receive treatment and the treated group received a MSC pellet containing 1.0 x 10(7) cells/mL associated with 50.0µL of plasma gel containing 1.0 x 10(9) autologous platelets within the defect. RESULTS: In the treated group was observed process of angiogenesis and bone repair better than control group. CONCLUSION: Mesenchymal stem cells derived from bone marrow of C57BL/6 gfp+ mice associated with PRP gel applied in bone critical defects produced in calvarial contributes positively to the process of bone repair.

OBJETIVO: Avaliar os efeitos da associação das células-tronco mesenquimais (MSC) oriundas da medula óssea de oito camundongos jovens C57BL/6 gfp+ e expandidas em culturas, com Plasma Rico em Plaquetas (PRP) provenientes de outros oito camundongos, na reparação de defeitos críticos confeccionados em calvária de 24 camundongos adultos C57BL/6. MÉTODOS: Os animais foram submetidos a um defeito craniano de 6,0mm de diâmetro e separados em dois grupos experimentais iguais. O grupo controle não recebeu tratamento e no grupo tratado foi administrado, no interior do defeito, pellet de MSC contendo 1,0 x 10(7) células/mL associado com 50,0µL de plasma em gel autólogo contendo 1,0 x 10(9) plaquetas. RESULTADOS: No grupo tratado verificou-se processo de angiogênese e reparação óssea superior ao grupo controle. CONCLUSÃO: A associação das células-tronco mesenquimais (MSC) derivadas da medula óssea de camundongos C57BL/6 gfp+ com gel de PRP aplicadas em defeitos ósseos críticos confeccionadas em calvária de camundongos C57BL/6 jovens, contribuiu positivamente para o processo de reparação óssea.

Terapia gênica com VEGF para angiogênese na angina refratária: ensaio clínico fase I/II / VEGF gene therapy for angiogenesis in refractory angina: phase I/II clinical trial

OBJETIVO: Avaliar a segurança, viabilidade e efeitos iniciais, clínicos e sobre a perfusão miocárdica, da administração intramiocárdica, transtorácica, de VEGF 165 plasmidial em pacientes com doença arterial coronariana avançada e angina refratária, não passíveis de revascularização percutânea e cirúrgica. MÉTODOS: Ensaio clínico fase I/II. Treze pacientes cardiopatas isquêmicos com angina refratária apesar de tratamento medicamentoso máximo por no mínimo seis meses, não passíveis de revascularização cirúrgica ou por cateter foram submetidos a injeções intramiocárdicas de 2000µg VEGF 165 plasmidial. Os pacientes foram avaliados por cintilografia miocárdica, teste ergométrico, questionário de qualidade de vida (Minnesota) e determinação das classes de insuficiência cardíaca (NYHA) e angina (CCS). RESULTADOS: Não houve óbitos ou reintervenções. Durante o período de tratamento medicamentoso máximo, não se observou diferenças em cintilografias miocárdicas, testes ergométricos e questionários de qualidade de vida, ainda, houve tendência a piora das classes NYHA (P=0,05) e CCS (P=0,05). Três meses após intervenção, observou-se melhora dos escores cintilográficos SSS (18,38±7,51 vs. 15,31±7,29, P=0,003) e SRS (11,92±7,49 vs. 8,53±6,68, P=0,002), porém não na proporção da extensão da área de miocárdio isquêmico (23,38±13,12 por cento vs. 20,08±13,88 por cento, P=0,1). Houve tendência a melhora dos METs nas ergometrias (7,66±4,47 vs. 10,29±4,36, P=0,08), melhora do escore de qualidade de vida (48,23±18,35 vs. 30,15±20,13; P=0,02) e das classes NYHA (3,15±0,38 vs. 1,77±0,83, P=0,001) e CCS (3,08±0,64 vs. 1,77±0,83, P=0,001), no mesmo período. CONCLUSÕES: A terapia demonstrou-se segura e viável nesta série de pacientes. Os resultados iniciais tendem a demonstrar melhora na gravidade da angina e redução da intensidade da isquemia miocárdica.

OBJECTIVE: Safety, feasibility and early myocardial angiogenic effects evaluation of transthoracic intramyocardial phVEGF165 administration for refractory angina in no option patients. METHODS: Cohort study, in which 13 patients with refractory angina under optimized clinical treatment where included, after cineangiograms had been evaluated and found unfeasible by surgeon and interventional cardiologist. Intramyocardial injections of 5mL solution containing plasmidial VEGF165 where done over the ischemic area of myocardium identified by previous SPECT/Sestamibi scan. Evaluations included a SPECT scan, stress test, Minnesotta QOL questionnaire and NYHA functional class and CCS angina class determinations. RESULTS: There were no deaths or new interventions during the study period. There were no significant variations in SPECT scans, QOL scores and stress tests results during medical treatment in the included patients. After the 3rd post operative month, there was improvement in SPECT segmental scores, SSS (18.38±7.51 vs. 15.31±7.29, P=0.003) and SRS (11.92±7.49 vs. 8.53±6.68, P=0.002). The ischemic area extension, however, had non-significant variation (23.38±13.12 percent vs. 20.08±13.88 percent, P=0.1). Stress tests METs varied from 7.66±4.47 pre to 10.29±4.36 METs post-op (P=0.08). QOL score improved from 48.23±18.35 pre to 30.15±20.13 post-op points (P=0.02). NYHA class was 3.15±0.38 pre vs. 1.77±0.83 post-op (P=0.001) and angina CCS class, 3.08±0.64 vs. 1.77±0.83 (P=0.001). CONCLUSIONS: Intramyocardial VEGF165 therapy for refractory angina, in this small trial of no option patients, resulted feasible and safe. Early clinical and scintilographic data showed improvements in symptoms and myocardial perfusion, with regression of ischemia severity in treated areas.

Osso liofilizado bovino não-desmineralizado com células-tronco mesenquimais para engenharia tecidual: estudo experimental em sítio heterotópico / Bovine non-demineralized lyophilized bone with mesenchymal stem cells for tissue engineering: experimental study in heterotopic site

Objetivo: Avaliar o uso de células da medula óssea, com potencial osteogênico, agregadas a estrutura tridimensional de osso liofilizado bovino não-desmineralizado para engenharia tecidual óssea. Método: Os animais doadores de células da medula óssea, assim como os animais receptores dos construtos ósseos, foram camundongos de linhagem isogênica C57Bl/6. Utilizou-se modelo experimental heterotópico, com a implantação de construtos de osso liofilizado bovino não-desmineralizado (OL) no plano subcutâneo no dorso dos animais. Foram organizados 4 grupos de comparação (n=10 animais em cada grupo): 1) OL isoladamente (grupo controle); 2) OL + células mononucleares da medula (CMM); 3) OL + células-tronco mesenquimais (CTM); 4) OL + células-tronco mesenquimais diferenciadas em meio osteoindutor (CTMdif). A aferição foi realizada após 5 semanas, com avaliação histológica e determinação da atividade de fosfatase alcalina. Resultados: A avaliação histológica não mostrou diferença entre os grupos de comparação, com a observação em todas as amostras de tecido conjuntivo fibroso rico em neovasos estendendo-se por entre as trabéculas ósseas, sem osteoblastos ou osteócitos viáveis e sem neoformação óssea. Os resultados da atividade de fosfatase alcalina também não mostraram diferença entre os grupos de comparação, com análise de variância entre os grupos mostrando p=0,867. Conclusões: Os resultados mostraram que, no modelo estudado e com os métodos utilizados, a adição de células da medula óssea com potencial osteogênico sobre estrutura de osso liofilizado bovino não-desmineralizado não agregou propriedades osteogênicas ao material. Este estudo não confirmou a perspectiva inicial de utilizá-lo como estrutura tridimensional e carreadora celular na engenharia tecidual óssea, sendo necessários estudos subseqüentes que o avaliem em outros modelos experimentais, e que explorem separadamente cada etapa metodológica que possa influir no sucesso da engenharia tecidual óssea.

Objective: To evaluate the use of bone marrow cells with osteogenic potential seeded on bovine nondemineralized lyophilized bone scaffolds for bone tissue engineering. Method: Bone marrow cells donors, as well as the receptors of the bone constructs were C57BI/6 isogenic line mice. A heterotopic experimental model was used, with implantation of the constructs into subcutaneous pouches on the backs of the animals. Four comparison groups were set (n=10 animals each group): 1) LB alone (control group); 2) LB + marrow mononuclear cells (MMC); 3) LB + mesenchymal stem cells (MST); 4) LB + mesenchymal stem cells differentiated in osteoinductive medium (MSTdif). The constructs were harvested 5 weeks after implantation for histological analysis and alkaline phosphatase activity test. Results: The histological analysis did not show differences among the comparison groups. In all samples fibrous connective tissue rich in neovessels was observed extending through bone trabeculae, without viable osteoblasts or osteocytes and without new bone formation. Likewise, results of the alkaline phosphatase activity have not shown any difference among comparison groups, with the analysis of variance between groups showing p value=0.867. Conclusions: In this experimental model and with the methods used, the addition of bone marrow cells with osteogenic potential to a bovine non-demineralized lyophilized bone structure did not add osteogenic properties to the material. The initial perspective of using it as a scaffold for bone tissue engineering could not be confirmed, and further studies are required to assess it in other experimental models, and to explore separately each methodological step that might influence the success of bone tissue engineering.

Autologous transplantation of bone marrow mononuclear stem cells by mini-thoracotomy in dilated cardiomyopathy: technique and early results / Transplante autólogo de células-tronco de medula óssea por mini-toracotomia: técnica e resultados iniciais

CONTEXT AND OBJECTIVES: There are few studies concerning bone marrow mononuclear cell (BMMC) transplantation in cases of nonischemic dilated cardiomyopathy. This study describes a novel technique of BMMC transplantation and the results up to one year after the procedure. DESIGN AND SETTING: This was a case series to evaluate the safety and viability of the procedure, at Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul. METHODS: Nine patients with symptomatic dilated cardiomyopathy, functional class III/IV and left ventricular ejection fraction (LVEF) < 35 percent received BMMC (9.6 ± 2.6 x 107 cells) at 20 sites in the ventricular wall, by means of thoracotomy of length 5 cm in the fifth left intercostal space. Echocardiograms and nuclear magnetic resonance (NMR) were performed. RESULTS: There were no major complications. The functional class results for the first six patients (preoperatively and at two, four, eight and twelve-month follow-ups, respectively) were: [IV-2, III-4] to [I-5, II-1] to [I-3, II-3] to [I-2, II-3] and [I-2, II-3]. Echocardiograms showed LVEF: 25.9 ± 8.2; 32.9 ± 10.4; 29.4 ± 7.2; 25.1 ± 7.9; 25.4 ± 6.8 percent (p = 0.023); and percent left ventricular (LV) fiber shortening: 12.6 ± 4.4; 16.4 ± 5.4; 14.3 ± 3.7; 12.1 ± 4.0; 12.2 ± 3.4 percent (p = 0.021). LV performance variation seen on NMR was non-significant. CONCLUSION: Intramyocardial transplantation of BMMC in dilated cardiomyopathy cases is feasible and safe. There were early improvements in symptoms and LV performance. Medium-term evaluation revealed regression of LV function, although maintaining improved functional class.

CONTEXTO E OBJETIVO: Há pouco estudos avaliando o transplante de células mononucleares da medula óssea (CMMO) na miocardiopatia dilatada não-isquêmica. O presente estudo descreve uma técnica de implante intramiocárdico de CMMO por mini-toracomia e resultados com até um ano de acompanhamento. TIPO DE ESTUDO E LOCAL: Série casos para avaliar segurança e viabilidade do procedimento, no Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul. MÉTODOS: Nove pacientes com miocardiopatia dilatada, em classe funcional III/IV e fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) < 35 por cento receberam CMMO (média 9,6 ± 2,6 x 107 células) em 20 pontos da parede livre do ventrículo esquerdo, através de toracotomia de 5 cm no quinto espaço intercostal esquerdo. Foram realizados ecocardiograma e ressonância nuclear magnética (RNM). RESULTADOS: Não ocorreram complicações maiores. Os resultados pré-operatórios aos 2, 4, 8 e 12 meses de acompanhamento dos seis primeiros pacientes são: classe funcional: IV-2, III-4 para I-5, II-1 para I-3, II-3 para I-2, II-3 e I-2, II-3. Ecocardiograma: FEVE = 25.9 ± 8.2, 32.9 ± 10.4, 29.4 ± 7.2, 25.1 ± 7.9, 25.4 ± 6.8 por cento (p = 0.023); Fração de encurtamento do ventrículo esquerdo (VE) = 12.6 ± 4.4, 16.4 ± 5.4, 14.3 ± 3.7, 12.1 ± 4.0, 12.2 ± 3.4 por cento (p = 0.021). RNM demonstrou diferenças discretas, não significativas. CONCLUSÕES: O implante intramiocárdico de células-tronco na miocardiopatia dilatada é viável e seguro. Houve melhora precoce nos sintomas e na performance de VE. Avaliação a médio prazo demonstrou regressão da função VE, mantendo, contudo, a melhora na qualidade de vida e na classe funcional.

A role for adeno-associated viral vectors in gene therapy: [review]

Gene therapy constitutes a therapeutic intervention based on modification of the genetic material of living cells, by correcting genetic defects or overexpressing therapeutic proteins. The success of gene therapy protocols depends on the availability of therapeutically suitable genes, appropriate gene delivery systems and proof of safety and efficacy. Recent advances on the development of gene delivery systems, particularly on viral vectors engineering and improved gene regulatory systems, have led to marked progress in this field. Although the available vector systems can successfully transfer genes into cells, the ideal delivery vehicle has not been found. In this context, adeno-associated virus vectors (AAV) are arising as a promising tool for a wide range of applications, due to a combination of characteristics such as lack of pathogenicity and immunogenicity, wide range of cell tropism and long-term gene expression. Since its isolation, the biological properties of the adeno-associated virus have been increasingly understood, improving our ability to manipulate and use it as a safe and efficient gene therapy vector of wide spectrum. In this work, we review the bases of gene therapy, main types of gene transfer systems and basic properties and use of AAV vectors.

Reconstrução de calota craniana com células-tronco mesenquimais indiferenciadas: estudo experimental / Skull reconstruction with undifferentiated mesenchymal stem cells: experimental study

Introdução: A cirurgia craniomaxilofacial utiliza enxertos freqüentemente para a reconstrução de perdas e deformidades esqueléticas. No entanto, essa rotina não é livre de problemas. Assim, técnicas novas vêm sendo estudadas. As células-tronco vêm ganhando notoriedade por sua capacidade potencial de regeneração. Dentro da cirurgia plástica e da engenharia de tecidos, elas poderão representar um arsenal importante para a reconstrução dos mais diversos tecidos, especialmente no caso das células-tronco mesenquimais (CTM). Objetivo: Comparar a reconstrução parcial da calota craniana de camundongos, com enxertos que contivessem ou não CTM indiferenciadas. Método: Foram utilizados camundongos isogênicos C57BL/6, fêmeas, adultas. Cada grupo foi composto inicialmente de 20 animais. Uma falha óssea de espessura total foi criada no osso parietal esquerdo do animal, medindo, aproximadamente, 5 x 3 mm. O grupo 1 (G1) foi reconstruído com osso liofilizado bovino (OL) e CTM; já o grupo 2 (G2) - controle da matriz -, apenas com OL. No caso do G1, o OL era deixado dentro da placa de cultivo por 24 horas antes do procedimento. Após quatro semanas, todos foram sacrificados em câmara de CO2. Para a avaliação histológica, foram utilizados os seguintes critérios histológicos: trabéculas ósseas neoformadas, atividade osteoblástica, absorção do transplante e viabilidade da medula óssea. Resultados: Foram analisadas 15 amostras no G1 e 19, no G2. A comparação estatística demonstrou diferença significativa entre o G1 e o G2 (p=0,002). A utilização de CTM determinou uma pontuação histológica maior nas amostras utilizadas. Discussão: A utilização de CTM indiferenciadas nos enxertos ósseos de OL pareceu melhorar a integração e a regeneração na área receptora. A escala histológica utilizada baseou-se em quatro critérios importantes, que demonstram a presença de uma atividade regenerativa após uma enxertia. As CTM podem ter um papel primário ou adjuvante na regeneração tecidual. Tal papel...

Beyond retrovirus infection: HIV meets gene therapy

The human immunodeficiency virus (HIV) is classified as a retrovirus because of its RNA genome and the fact that it requires reverse transcriptase to convert it into DNA. This virus belongs to the lentivirinae subfamily and is able to infect quiescent cells but is better known for its association with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and can be described as one of the most effective vectors for gene transfer. Biosafety concerns are present whenever viral vectors are employed but are particularly pertinent to the development of HIV-based vectors. Insertional mutagenesis and the production of new replication-competent viruses (RCV) have been pointed to as major problems, but experimental data have shown that safe protocols can be developed for their production and application. Virological, evolutionary, immunological and cell biology studies must be conducted jointly to allow the clinical use of HIV vectors. This review will focus on the general properties, production and applications of retrovectors in gene therapy, with particular emphasis on those based on HIV systems.

Terapia gênica / Gene therapy

Terapia gênica é um procedimento médico que envolve a modificação genética de células como forma de tratar doenças. Os genes influenciam praticamente todas as doenças humanas, seja pela codificação de proteínas anormais diretamente responsáveis pela doença, seja por determinar suscetibilidade a agentes ambientais que a induzem. A terapia gênica é ainda experimental, e está sendo estudada em protocolos clínicos para diferentes tipos de doenças. O desenvolvimento de métodos seguros e eficientes de transferência gênica para células humanas é um dos pontos mais importantes na terapia gênica. Apesar do grande esforço dirigido na última década para o aperfeiçoamento dos protocolos de terapia gênica humana, e dos avanços importantes na pesquisa básica, as aplicações terapêuticas da tecnologia de transferência gênica continuam ainda em grande parte teóricas. O potencial da terapia gênica é muito grande, devendo ainda causar grande impacto em todos os aspectos da medicina.

Análise citotóxica de esparfloxacino e seus produtos de degradação em células mononucleares humanas / Cytotoxic activity of sparfloxacin and its degradation products in mononuclear human blood cells

O esparfloxacino (SPAX) é uma fluoroquinolona antibacteriana de amplo espectro e apresenta potente atividade contra bactérias gram-positivas, incluindo Streptococcus pneumoniae e Staphylococcus aureus inclusive cepas meticilina resistentes (MRSA), bactérias gram-negativas, não fermentadoras de glicose, anaeróbios, Legionella spp; Mycoplasma spp; Chlamydia spp e Mycobacterium spp. Uma importante característica desta classe de antimicrobianos é a fototoxicidade. Esparfloxacino tem sido estudado quanto às suas atividades terapêuticas, entretanto poucos métodos de análise são descritos na literatura. Este trabalho objetivou a determinação dos efeitos citotóxicos de esparfloxacino substância de referência (SPAX-SR), esparfloxacino comprimidos (SPAX-COMP), esparfloxacino comprimidos submetidos à luz por 36 horas (SPAX-COMP.36), e dois produtos (7 e 9) isolados após a fotodegradação de esparfloxacino sob luz UV-C nas concentrações de 31,25; 62,5; 125 e 250 µg/mL, sobre o cultivo in vitro de células mononucleares humanas. Os resultados, analisados estatisticamente pelo Teste de Tukey demonstraram que as soluções de esparfloxacino (SPAX-SR), SPAX-COMP e SPAX-COMP.36 em concentração de 250 µg/mL reduziram significativamente o número de células viáveis nestas condições. Este resultado não foi observado para as soluções das substâncias 7 e 9, o que sugere que estes produtos sejam menos citotóxicos do que o SPAX-SR, nas condições empregadas.

Diferenciação entre os vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina (BHV-1) e hipersvírus da encefalite bovina (BHV-5) com anticorpos monoclonais / Monoclonal antibody differentiation between bovine herpesviruses type 1 and 5

Amostras de herpesvírus bovinos (BHV) tipo 1 (Virus da Rinotraqueíte Infecciosa Bovina/Vulvovaginite Pustular Infecciosa; BHV-1) e tipo 5 (Herpesvírus da Encefalite Bovina; BHV-5) tiveram seu perfil de reatividade analisado em testes de imunoperoxidase frente a um painel composto por cinco anticorpos monoclonais (AcM) produzidos contra antígenos de BHV-1. Um dos AcM reconheceu todas as amostras de BHV examinadas. Os quatro AcM restantes reconheceram somente amostras de BHV-1. Todas as amostras isoladas de casos de encefalites (BHV-5) apresentaram um padrão de reação distinto daquelas isoladas de outros síndromes associados à infecção pelo BHV-1. Os resultados obtidos indicam que os AcM avaliados permitem a diferenciação entre amostras de BHV-1 e BHV-5, havendo perfeita correlação entre os quadros clínicos observados com os perfis de reatividade obtidos in vitro