Rotavírus A e norovírus em crianças da comunidade de Manguinhos, Rio de Janeiro: susceptibilidade do hospedeiro, monitoramento do vírus vacinal RV1 e genótipos circulantes / Rotavirus A and norovirus in children from the community of Manguinhos, Rio de Janeiro: host susceptibility, monitoring of the RV1 vaccine virus and circulating genotypes

Os rotavírus A (RVA) e os norovírus são os principais vírus associados à etiologia da gastroenterite aguda (GA) em <5 anos. A partir de 2006, com a introdução das vacinas de RVA, observou-se um declínio expressivo da morbidade/mortalidade por estes vírus, em detrimento a crescente importância das infecções pelos norovírus nesta faixa etária. Antígenos do grupo histosanguíneo humano (HBGAs), presentes na mucosa intestinal, têm sido descritos como potenciais ligantes e/ou cofatores requeridos nos estágios da patogênese das infecções por estes vírus, influenciando na epidemiologia molecular e evolução em diferentes populações. Este estudo teve como objetivo associar o perfil de susceptibilidade (HBGA/Secretor/Lewis) de crianças residentes na comunidade de Manguinhos, no Rio de Janeiro, à eficácia da resposta a vacina RV1 (Rotarix®/G1P[8]), assim como às infecções naturais pelos norovírus. Com este propósito realizou-se o monitoramento das infecções por RVA e norovírus em uma coorte de crianças de 0-11 meses, pela detecção e caracterização molecular destes vírus em amostras de fezes de crianças sintomáticas ou não. No período de 2014 a 2018, 132 crianças foram incluídas neste estudo, disponibilizando o mesmo número de amostras de saliva para determinação do perfil de susceptibilidade por ELISA e 569 amostras de fezes para investigação de ambos os vírus por métodos moleculares.

O vírus vacinal excretado foi caracterizado em 78% (85/109) das amostras RVA. A presença da mutação F167L (RV1), demonstrada pelo sequenciamento do gene VP8*, foi observada em 20,1% das crianças. Quatro casos de rotaviroses pelos genótipos G3P[8], G12P[8] e G3P[9] foram observados. Os norovírus foram detectados em 21,2% (28/132) das crianças, com incidência de 5,8 infecções em 100 criança-meses. A razão de detecção foi de 5,6% (17,1% dos casos diarrêicos e 4,7% dos assintomáticos), sendo seis diferentes genótipos detectados (GII.4_Sydney_2012[P31], GII.4_Sydney_2012[P16],GII.4_Sydney_2012[P4_New_Orleans_2009],GII.2[P16],GII.6[P7] e GI.3[P13]). Em relação ao perfil HBGA, observou-se 80,3% das crianças com o status secretor. A caracterização do gene FUT2 (Se) em crianças secretoras Le (a+b+) e não secretoras, e do gene FUT3 (Le) em Le (a-b-), possibilitou a identificação de novas mutações nesta população.

A mutação F167L na RV1 excretada foi identificada em 86,4% das crianças que apresentaram o fenótipo secretor Le (a+b+), indicando que os HBGAs poderiam ser importantes marcadores na avaliação da RV1; significante associação entre infecção sintomática pelos norovírus e o status secretor (Leb) também foi observada. A ocorrência de norovírus na coorte e a sua crescente importância epidemiológica, determinou a ampliação deste estudo, com a análise de 61 amostras fecais oriundas de 49 crianças na faixa etária de 1-4 anos residentes em Manguinhos. Os norovírus foram detectados em 47,5% (29/61) das amostras (46,7% dos casos diarrêicos e 50% dos assintomáticos) e quatro novos genótipos foram identificados, sendo o recombinante GII.2[P16] detectado pela primeira vez no Brasil. Os dados de vigilância epidemiológica deste estudo comprovam a importância do monitoramento dos principais vírus responsáveis pela gastroenterite infantil aguda, evidenciando a diversidade genética e a dinâmica destes vírus considerando novas abordagens como o perfil HBGA, que trouxe uma importante contribuição em relação à avaliação da eficácia da RV1 na coorte estudada. (AU)

Validation of PCR method for mycoplasma detection in the Yellow Fever-vaccine quality control / Validação de método de PCR para detecção de micoplasmasno controle de qualidade da vacina de Febre Amarela

Among the vaccines produced by Bio-Manguinhos, a major centre for manufacturingthe immunobiological products in Latin America, stands out the yellow fever (YF) vaccine.To guarantee the excellence and safety of the YF vaccine, the quality control tests has to be performedthroughout its production. The World Health Organization (WHO) demands the producersto guarantee the absence of Mycoplasma orale, M. pneumoniae, M. gallisepticum and M. synoviaein the biological products. Mycoplasma is a fastidious microorganism, requiring about 35 daysfor attaining the conclusive culturing test. In this study PCR methods were selected for amplifying16S rRNA gene fragments for detecting mycoplasma in the intermediate products of YF vaccine.This standardized methodology was specific and sensitive to detect the low concentrations of mycoplasma in spiked intermediary vaccine products; and the absence of unspecific amplification was also demonstrated. The detection rates ranged from 3.1 to 12.5 colony formingunits and showed 100 % of sensitivity and specificity in the tested samples. The PCR protocol for detecting mycoplasmal DNA in YF vaccine was validated by analysing 286 samples. Bio-Manguinhos produces annually 10,000,000 YF vaccine doses, and this method has been successfully employed, complementing the traditional approach in the mycoplasma detection since 2008.

Dentre as vacinas produzidas por Bio-Manguinhos, um importante centro de produção deimunobiológicos da América Latina, destaca-se a vacina de febre amarela (FA) que é produzidaem ovos embrionados. Para garantir a excelência e a segurança da vacina, testes de controlede qualidade são realizados durante a produção. A Organização Mundial de Saúde (OMS) exigedos produtores a ausência de Mycoplasma orale, M. pneumoniae, M. gallisepticum e M. synoviaeem produtos biológicos. Micoplasmas são micro-organismos fastidiosos, sendo necessários35 dias para que os testes de cultura sejam conclusivos. Neste estudo foram selecionadosmétodos de amplificação de fragmentos do gene 16S rRNA para detecção de micoplasmas emprodutos intermediários da vacina de FA. Esta metodologia padronizada foi capaz de detectarbaixas concentrações de micoplasmas nos produtos intermediários e a ausência de amplificaçãoinespecífica foi demonstrada. O limite de detecção variou entre 3,1 e 12,5 unidades formadorasde colônia; e nas amostras testadas a sensibilidade e a especificidade foram de 100 %. O protocolode PCR para detecção de micoplasmas na vacina foi validado pela análise de 286 amostras.Bio-Manguinhos produz 10.000.000 doses de vacina de febre amarela por ano e, desde 2008,este método tem sido empregado com sucesso, complementando-se a abordagem tradicional.

Validation of PCR method for mycoplasma detection in the Yellow Fever-vaccine quality control / Validação de método de PCR para detecção de micoplasmas no controle de qualidade da vacina de Febre Amarela

Among the vaccines produced by Bio-Manguinhos, a major centre for manufacturing the immunobiological products in Latin America, stands out the yellow fever (YF) vaccine. To guarantee the excellence and safety of the YF vaccine, the quality control tests has to be performed throughout its production. The World Health Organization (WHO) demands the producers to guarantee the absence of Mycoplasma orale, M. pneumoniae, M. gallisepticum and M. synoviae in the biological products. Mycoplasma is a fastidious microorganism, requiring about 35 days for attaining the conclusive culturing test. In this study PCR methods were selected for amplifying 16S rRNA gene fragments for detecting mycoplasma in the intermediate products of YF vaccine. This standardized methodology was specific and sensitive to detect the low concentrations of mycoplasma in spiked intermediary vaccine products; and the absence of unspecific amplification was also demonstrated. The detection rates ranged from 3.1 to 12.5 colony forming units and showed 100 % of sensitivity and specificity in the tested samples. The PCR protocol for detecting mycoplasmal DNA in YF vaccine was validated by analysing 286 samples. Bio-Manguinhos produces annually 10,000,000 YF vaccine doses, and this method has been successfully employed, complementing the traditional approach in the mycoplasma detection since 2008.

Dentre as vacinas produzidas por Bio-Manguinhos, um importante centro de produção de imunobiológicos da América Latina, destaca-se a vacina de febre amarela (FA) que é produzida em ovos embrionados. Para garantir a excelência e a segurança da vacina, testes de controle de qualidade são realizados durante a produção. A Organização Mundial de Saúde (OMS) exige dos produtores a ausência de Mycoplasma orale, M. pneumoniae, M. gallisepticum e M. synoviae em produtos biológicos. Micoplasmas são micro-organismos fastidiosos, sendo necessários 35 dias para que os testes de cultura sejam conclusivos. Neste estudo foram selecionados métodos de amplificação de fragmentos do gene 16S rRNA para detecção de micoplasmas em produtos intermediários da vacina de FA. Esta metodologia padronizada foi capaz de detectar baixas concentrações de micoplasmas nos produtos intermediários e a ausência de amplificação inespecífica foi demonstrada. O limite de detecção variou entre 3,1 e 12,5 unidades formadoras de colônia; e nas amostras testadas a sensibilidade e a especificidade foram de 100 %. O protocolo de PCR para detecção de micoplasmas na vacina foi validado pela análise de 286 amostras. Bio-Manguinhos produz 10.000.000 doses de vacina de febre amarela por ano e, desde 2008, este método tem sido empregado com sucesso, complementando-se a abordagem tradicional.

Estudo colaborativo nacional para o estabelecimento do material de referência de trabalho da vacina contra sarampo, caxumba e rubéola: evolução para a autossuficência na produção nacional da vacina tríplice viral / National collaborative study for establishing the working reference material of the vaccine against measles/mumps and rubella: evolution to the self-sufficiency in the national production of triple viral vaccine

A monografia farmacopeica da vacina tríplice viral (sarampo/caxumba/rubéola) exige a validação de desempenho do ensaio de potência utilizando-se apropriado material de referência (MR). Com o intuito de estabelecer o primeiro MR de trabalho (MRT) nacional para a vacina tríplice viral, foi realizado o estudo colaborativo nacional com a participação de duas únicas instituições que executam o ensaio de potência desta vacina, o Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos (Bio-Manguinhos, produtor nacional) e o Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde.O material candidato (cMRTBio), preparado pelo produtor, foi avaliado pelos laboratórios participantes utilizando-se as respectivas metodologias in-house de determinação de potência. O cMRTBio foi considerado apropriado como MR in-house por estar em concordância com as especificações recomendadas nas normativas de compêndios, a saber: variações intra- (< 5 %), inter-ensaios (< 10 %) e entre laboratórios (< 10 %) abaixo dos limites aceitáveis; e potência estimada (log10 CCID50/DH) em 3,72 para sarampo, 4,80 para caxumba e 3,70 para rubéola. Este trabalho reflete o compromisso do único produtor nacional da vacina tríplice viral com a saúde pública, descrevendo-se a expansão da tecnologia, o cumprimento às diretrizes internacionais, o cuidado com o controle da qualidade e culminância para a autossuficiência nacional na produção de vacinas.

The pharmacopoeia monograph for the measles/mumps and rubella (MMR) triple vaccine demands to perform the validation of the potency assay by using the suitable reference material (MR). Aiming at establishing the firstwork MR (MRT) for the MMR triple vaccine, a national collaborative study was performed with the participation of the two unique national institutions working on the vaccine potency evaluation test, the Imunobiological Technology Institute (Bio-Manguinhos, national manufacturer) and the National Institute for Quality Control in Health. The candidate product (cMRTBio) prepared by the manufacturer was evaluated by the participant laboratories by employing the respective in-house methodologies for determining the potency. The cMRTBio was considered suitable as in-house MR, according to the specifications based on the normative compendia, being the intra-assay (< 5 %), inter-assay(< 10 %) and between laboratories variations (< 10 %) below the acceptable limits, and the estimate potency(log10 CCID50/DH) in 3.72 for measles, 4.80 for mumps and 3.70 for rubella. This study reflects the commitment of the unique national MMR vaccine producer to the public health, describing the expansion of technology,the compliance with international guidelines and the careful quality control, leading to the national self-sufficiency in the vaccine production.