RESUMO
INTRODUÇÃO: Microdissecção e captura a laser (MCL) é uma técnica de desenvolvimento recente que permite a coleta de células individuais ou pequeno conjunto de células para análise molecular. Atualmente, no Brasil, há raros microscópios para MCL, de modo que a divulgação dos procedimentos inerentes a essa técnica é oportuna para destacar seu amplo potencial para diagnóstico e investigação. OBJETIVO: Este trabalho descreve a padronização dos procedimentos de MCL e de extração de DNA de material fixado em formalina e incluído em parafina. MATERIAL E MÉTODOS: Foram estudados o éxon 8 do gene TP53 e o gene da ciclofilina em amostras de tecido normal e de neoplasias de fígado e rim provenientes de modelo de carcinogênese química induzida em rato. A extração do DNA foi comprovada por reação em cadeia da polimerase (nested-PCR). RESULTADOS: Foram padronizados os procedimentos de preparo dos cortes histológicos, de microdissecção e captura a laser e de obtenção de seqüências gênicas pela reação de nested-PCR para tecidos incluídos em parafina. Obtivemos amplificação de 48,3 por cento das amostras para o éxon 8 do gene TP53 e 51,7 por cento para o gene da ciclofilina. Considerando pelo menos um dos dois segmentos gênicos, foram amplificadas 79,3 por cento das amostras. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO: A extração de DNA de tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina e a técnica de nested-PCR foram adequadamente padronizadas para produtos gênicos de interesse, obtidos de material coletado por MCL. Esses procedimentos podem ser úteis para a obtenção de seqüências de DNA de arquivos para análise molecular.
BACKGORUND: Laser-capture micro-dissection (LCM) is a recently developed procedure that provides single cells or specific cell groups for molecular analysis. Currently, there are few LCM systems in Brazil, in such a way that it is necessary to disseminate the technical procedures inherent to the methodology, and also to characterize its enormous potential for diagnosis and research. OBJECTIVE: This study describes the standardization of LCM and DNA extraction from formalin fixed and paraffin-embedded tissues. MATERIAL AND METHOD: The gene TP53 exon 8 and the cyclophilin gene were studied in normal and neoplastic liver and kidney samples from a chemical carcinogenesis model in rat. DNA extraction was confirmed by nested-PCR. RESULTS: Histological sections preparation for LCM and the nested-PCR procedures were standardized; 48.3 percent amplifications of the gene TP53 exon 8 and 51.7 percent of the cyclophilin gene samples were obtained. When at least one of the gene segments was considered, 79.3 percent samples presented amplification. DISCUSSION AND CONCLUSION: Procedures for DNA extraction from formalin fixed and paraffin-embedded tissues collected by LCM were standardized. They can be useful for DNA collection for molecular studies.
Assuntos
Animais , Ratos , Ciclofilinas/genética , DNA , /genética , Lasers , Microdissecção/métodos , Reação em Cadeia da PolimeraseRESUMO
Atualmente, o método mais importante para a identificaçao de agentes químicos cancerígenos é o teste de longa duraçao in vivo, com roedores. No Brasil nao há condiçoes para a sua execuçao, devido à inexistência de especialistas e de infra-estrutura adequada. Em conseqüência, o país é dependente dos conhecimentos gerados no exterior sobre o risco que determinados compostos químicos impoem às populaçoes e ao meio ambiente. Por outro lado, as desvantagens inerentes ao protocolo deste teste, como a complexidade na execuçao, o tempo prolongado para obtençao das conclusoes e custo elevado, entre outras, levam à procura de alternativas mais convenientes. No presente trabalho sao apresentados dois testes in vivo para detecçao de cancerígenos químicos em ratos, que têm como vantagens o tempo de execuçao e o custo, menores que os do teste convencional. Os sistemas propostos têm só-o-fígado ou vários-órgaos-simultâneos como órgaos-alvo do eventual cancerígeno. Ambos os testes foram avaliados respectivamente com centenas e dezenas de substâncias químicas e reproduziram os resultados já obtidos em testes de longa duraçao, mostrando forte consistência biológica. Os autores destacam as vantagens de sua adoçao em países como o Brasil e propoem sua inclusao na seqüência de testes necessários para caracterizar um agente químico como cancerígeno.