Bovine conceptus of Bos indicus produced by somatic cell nuclear transfer and parthenogenesis present morphological variations since the blastocyst stage / Conceptos bovinos (Bos indicus) produzidos por transferência nuclear de células somáticas e partenogênese apresentam variações morfológicas desde o estágio de blastocisto

In cattle, embryo development is characterized by the appearance of two distinct cell layers, the trophectoderm and the inner cell mass. The latter will undergo differentiation to form the embryonic disc consisting of the epiblast and hypoblast. The aim of this study was to ultrastructurally characterize the bovine embryo from different in vitro production techniques, with emphasis on trophectoderm and inner cell mass cells. Bovine embryos on day 7 (conception = D1) of pregnancy, derived via in vitro production techniques, were fixed for light and transmission electron microscopy processing. Results suggested that embryos produced by nuclear transfer of somatic cells and parthenogenesis showed significant changes in macroscopic and microscopic structure. Size was reduced, and the inner cell mass had no defined shape. Furthermore, organelles responsible for the absorption processes, communication, growth, and cellular metabolism were fewer and had changes in shape, when compared to results in embryos produced by in vitrofertilization. We concluded that embryos produced by parthenogenesis and SCNT exhibit morphological differences when compared with IVF embryos, such as undeveloped blastocoel, poorly defined distribution of ICM, and morphological differences in organelles.

Em bovinos, o desenvolvimento embrionário é caracterizado pelo surgimento de duas camadas distintas, o trofectoderma e a massa celular interna. Este último irá sofrer diferenciação para formar o disco embrionário, o qual consiste em epiblasto e hipoblasto. O objetivo deste estudo foi caracterizar ultraestruturalmente o embrião bovino proveniente de diferentes técnicas de produção in vitro, com ênfase no trofectoderma e na massa celular interna. Embriões bovinos com sete dias de gestação (fecundação = D1), derivados de técnicas de produção in vitro, foram fixados para processamento de microscopia de luz e eletrônica de transmissão. Os resultados sugerem que os embriões produzidos por transferência nuclear de células somáticas e partenogênese apresentaram alterações significativas em suas estruturas macro e microscópica. O tamanho foi reduzido, e a massa celular interna não tinha uma forma definida. Além disso, organelas responsáveis por processos de absorção, comunicação, crescimento e metabolismo celular estavam em menor número e tinham alterações na forma quando comparadas aos resultados em embriões produzidos por fertilização in vitro. Conclui-se que os embriões produzidos por SCNT e partenogênese apresentam diferenças morfológicas quando comparados aos embriões de fertilização in vitro, tais como blastocele pouco desenvolvida, massa celular interna pouco definida e diferenças morfológicas nas organelas.

Oocyte activation and preimplantation development of bovine embryos obtained by specific inhibition of cyclin-dependent kinases

The efficiency of bohemine and roscovitine in combination with ionomycin on parthenogenetic activation and initial embryonic development of bovine oocytes was studied. Two experiments were performed: in the first, different concentrations (0, 50, 75 or 100æM) and different exposure periods (2, 4 or 6 hours) to bohemine or roscovitine were tested for activation rates of in vitro matured (IVM) bovine oocytes, which were pre-exposed to ionomycin. The best treatments, 75µM bohemine and 50µM roscovitine, both for 6h, were used in the second experiment, in which IVM bovine oocytes were exposed to ionomycin, followed or not by bohemine or roscovitine treatment, and evaluated for nuclear status, activation rate and blastocyst development were assessed. The combined treatments (ionomycin + cyclin-dependent kinases inhibitors - CDKIs) showed better results for activation rates (77.3 percent) and initial embryonic development (35.2 percent) than the single ionomycin treatment (69.4 percent for activation and 21.9 percent for development); and also lead to a more uniform activation (nearly 90 percent single pronucleus development). The results showed that CDKIs improve the effects of ionomycin on parthenogenetic activation and blastocyst development in bovine oocytes and could help to achieve more efficient activation protocols, increasing the developmental competence of embryos obtained by reproductive biotechniques.

Realizaram-se dois experimentos para avaliar a eficiência da bohemina e roscovitina associadas à ionomicina para ativação partenogenética e desenvolvimento embrionário inicial de bovinos. No primeiro, foram testadas diferentes concentrações (0, 50, 75 ou 100æM) e diferentes tempos de exposição (2, 4 ou 6 horas) à bohemina ou à roscovitina na ativação de oócitos bovinos maturados in vitro (MIV) pré-expostos à ionomicina. Os melhores tratamentos, bohemina 75µM e roscovitina 50µM, ambos por seis horas, foram utilizados no segundo experimento, no qual oócitos bovinos MIV foram expostos à ionomicina seguido ou não pelo tratamento com inibidores específicos das quinases dependentes de ciclina (CDKI), e avaliados quanto à configuração nuclear, taxa de ativação e desenvolvimento até blastocisto. Os tratamentos combinados (ionomicina+CDKI) apresentaram melhor taxa de ativação (77,3 por cento) e desenvolvimento embrionário inicial (35,2 por cento) do que a ionomicina sozinha (69,4 por cento e 21,9 por cento, respectivamente), e também promoveram ativação mais uniforme (aproximadamente 90 por cento de formação de um pronúcleo). Estes resultados demonstram que os CDKIs potencializam o efeito da ionomicina na ativação e desenvolvimento embrionário inicial e podem auxiliar na obtenção de protocolos de ativação mais eficientes, aumentando a capacidade de desenvolvimento de embriões produzidos por meio de biotécnicas reprodutivas.