The infection of microvascular endothelial cells with ExoU-producing Pseudomonas aeruginosa triggers the release of von Willebrand factor and platelet adhesion

An increased plasma concentration of von Willebrand factor (vWF) is detected in individuals with many infectious diseases and is accepted as a marker of endothelium activation and prothrombotic condition. To determine whether ExoU, a Pseudomonas aeruginosa cytotoxin with proinflammatory activity, enhances the release of vWF, microvascular endothelial cells were infected with the ExoU-producing PA103 P. aeruginosa strain or an exoU-deficient mutant. Significantly increased vWF concentrations were detected in conditioned medium and subendothelial extracellular matrix from cultures infected with the wild-type bacteria, as determined by enzyme-linked immunoassays. PA103-infected cells also released higher concentrations of procoagulant microparticles containing increased amounts of membrane-associated vWF, as determined by flow cytometric analyses of cell culture supernatants. Both flow cytometry and confocal microscopy showed that increased amounts of vWF were associated with cytoplasmic membranes from cells infected with the ExoU-producing bacteria. PA103-infected cultures exposed to platelet suspensions exhibited increased percentages of cells with platelet adhesion. Because no modulation of the vWF mRNA levels was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction assays in PA103-infected cells, ExoU is likely to have induced the release of vWF from cytoplasmic stores rather than vWF gene transcription. Such release is likely to modify the thromboresistance of microvascular endothelial cells.

ExoU contributes to late killing of Pseudomonas aeruginosa - infected endothelial cells

Para determinar o papel de ExoU na citotoxicidade tardia de P. aeruginosa, células endoteliais (CE) foram expostas às cepas PA103, PA103DxoU e PA103::exsA por 1h e à gentamicina em meio de cultura. Após 24h, a viabilidade das CE infectadas com PA103 (33.7 ± 14.3%) foi inferior à de CE infectadas com PA103DexoU (77.7 ± 6.3%) e PA103::exsA (79.5 ± 23.3%). A citotoxicidade não dependeu da capacidade de interagir com as CE porque o percentual de células com bactérias associadas em culturas expostas a PA103 foi semelhante ao percentual em culturas expostas a PA103DexoU e inferior em culturas expostas a PA103::exsA. O tratamento das CE com citocalasina D reduziu a internalização de PA103, mas não interferiu em sua citotoxicidade.

ExoU contributes to late killing of Pseudomonas aeruginosa - infected endothelial cells

To ascertain the role of ExoU in late P. aeruginosa cytotoxicity, endothelial cells (EC) were exposed to wild type PA103, PA103deltaexoU and PA103::exsA for 1h and to gentamicin in culture medium. After 24h, the viability of PA103-infected cells (33.7 ± 14.3%) was significantly lower than the viability of PA103deltaexoU- (77.7 ± 6.3%) or PA103::exsA- (79.5 ± 23.3%) infected EC. P. aeruginosa cytotoxicity did not depend on the bacterial ability to interact with EC because the percentage of cells with associated PA103 (35.9 ± 15.8%) was similar to the percentage in PA103deltaexoU- (34.2 ± 16.0%) and lower than the percentage in PA103::exsA-infected cultures (82.9 ± 18.9%). Cell treatment with cytochalasin D reduced the PA103 internalization by EC but did not interfere with its ability to kill host cells.

Para determinar o papel de ExoU na citotoxicidade tardia de P. aeruginosa, células endoteliais (CE) foram expostas às cepas PA103, PA103deltaxoU e PA103::exsA por 1h e à gentamicina em meio de cultura. Após 24h, a viabilidade das CE infectadas com PA103 (33.7 ± 14.3%) foi inferior à de CE infectadas com PA103deltaexoU (77.7 ± 6.3%) e PA103::exsA (79.5 ± 23.3%). A citotoxicidade não dependeu da capacidade de interagir com as CE porque o percentual de células com bactérias associadas em culturas expostas a PA103 foi semelhante ao percentual em culturas expostas a PA103deltaexoU e inferior em culturas expostas a PA103::exsA. O tratamento das CE com citocalasina D reduziu a internalização de PA103, mas não interferiu em sua citotoxicidade.

Methods to assess bacterial interaction with cultured mammalian cells

A virulência de muitos patógenos humanos parece depender de sua capacidade de aderir e de invadir células das mucosas hospedeiras. As culturas de células de mamíferos säo instrumentos de grande utilidade para a elucidaçäo dos fatores bacterianos e das células hospedeiras envolvidos nos fenômenos de aderência e de invasäo celular. Na medida do possível, as células escolhidas para os ensaios devem se assemelhar às células naturalmente colonizadas e com que as bactérias interagem in vivo. As culturas de células também apresentam algumas limitaçöes que devem ser levadas em consideraçäo toda vez que pretendemos extrapolar os resultados obtidos in vitro para fenômenos que ocorrem in vitro para fenômenos que ocorrem in vivo. Neste artigo discutimos algumas vantagens e desvantagens de diferentes métodos utilizados para estudar a aderência bacteriana e para distinguir microrganismos que permanecem aderidos à superfície das células de outras que säo por elas internalizadas. Além da capacidade de reconhecer epitopos presentes nas membranas de células eucarióticas, as adesinas bacterianas também podem ter uma atividade tóxica e induzir a morte da célula hospedeira, tanto por necrose quanto por apoptose. Neste artigo apresenta-se alguns dos métodos utilizados para avaliar a viabilidade celular, principalmente métodos que detectam a perda da permeabilidade das membranas e métodos que detectam distúrbios das funçöes celulares vitais. Finalmente, discutimos como células necróticas e apoptóticas podem ser diferenciadas

A simple method for evaluation of delayed hypersensitivity in mice

A determinaçäo da presença de reaçöes de hipersensibilidade retardada (RHR) em camundongos é habitualmente feita pela evidenciaçäo do aumento de espessura de um dos coxins plantares posteriores, inoculado com o antígeno, comparado com o coxim contralateral, inoculado com soluçäo salina. Essa avaliaçäo é, no entanto, difícil devido a dificuldade inerente à leitura do teste. Visando à avaliaçäo de um método alternativo de pesquisa das RHR, camundongos foram imunizados com Listeria monocytogenes e submetidos ao teste 4 dias, 1, 2, e 4 semanas após a imunizaçäo. Tanto a diferença de espessura, quanto a de peso entre os dois coxins posteriores, de cada animal, foram determinadas. Para avaliaçäo da sensibilidade do novo método foi demonstrada a coincidência do aparecimentos das RHR e da resistência adquirida à reinfecçäo pelo mesmo organismo, por medio do teste de depuraçäo esplênica de germes inoculados por via intraperitoneal. O método proposto mostrou-se de fácil realizaçäo e de leitura precisa apresentando, ainda, boa correlaçäo com o teste de depuraçäo esplênica e com as determinaçöes do aumento de espessura

Diagnóstico bacteriológico nas infecçöes respiratórias baixas / Bacteriological diagnosis of lower respiratory tract infections

Faz-se uma revisäo dos métodos de diagnóstico bacteriológico das infecçöes respiratórias baixas. Assinalam a inadequaçäo do cultivo qualitativo do escarro expectorado, sem que tenham sido tomadas medidas destinadas à detecçäo do grau de sua contaminaçäo pela flora microbiana oral. Propöem que a colheita do escarro seja sistematicamente precedida pela rinçagem da boca com salina estéril, seguida pela colocaçäo de tampöes de algodäo nos orifícios de drenagem das glândulas salivares. O processamento do espécime obtido deve ser precoce. Caso contrário, recomenda-se a sua refrigeraçäo por até 20 h. O cultivo quantitativo do escarro deve ser feito após homogeneizaçäo com agentes mucolíticos. Paralelamente, deve ser feita a contagem de leucócitos no escarro, de grande valor para a interpretaçäo dos resultados obtidos. Discute-se o emprego de métodos mais agressivos como punçäo transtraqueal, aspiraçäo através de fibrobroncoscópio e punçäo percutânea pulmonar, técnicas estas que devem ser reservadas para casos especiais

Testes fisiológicos para a diferenciaçäo de estreptococos beta hemolíticos de interesse humano / Physiological tests for differentiation of beta hemolytic streptoccci of human significance

Alguns testes fisiológicos para a diferenciaçäo de Streptococcus beta hemolíticos humanos dos sorogrupos A, B, C, D e G foram avaliados. Cento e oitenta e seis amostras foram estudadas e grupadas sorologicamente, correspondendo a 50 grupo A, 60 grupo B, 15 grupo C, 38 grupo D e 23 grupo G. Observa-se boa correlaçäo quando consideramos a sensibilidade à bacitracina, teste CAMP, hidrólise do hipurato, produçäo de pigmento, crescimento na presença de bile esculina e em caldo com NaCL a 6,5% e, a sorogrupagem das amostras estudadas. A sensibilidade ao teste da bacitracina foi de 86% para o grupo A, mas foram encontradas reaçöes falso-positivas para os Streptococcus dos grupos C e G. O comportamento das amostras do grupo A distribuiu-se entre 9 padröes, quando consideramos todos os testes fisiológicos. O teste CAMP, produçäo de pigmento e hidrólise do hipurato (método ráoido) foram igualmente sensíveis em relaçäo ao grupo B, sendo os dois primeiros testes os mais específicos para o grupo (73,3 e 80%, respectivamente). Vinte e dois padröes foram encontrados entre as amostras do grupo B. A sensibilidade dos testes NaCl 6,5% e bile esculina foi de 100% para o grupo D, com reaçöes falso-positivas observadas no grupo B. Sete padröes de comportamento foram observados para o grupo D. Esquemas simples para diferenciar os estreptococos dos grupos A, B e D säo apresentados, com base na experiência relatada acima. As amostras dos grupos C e G foram reconhecidas principalmente por serem inativas na maioria dos testes usados