Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of Salmonella in artificially inoculated chicken meat

The aim of this study was to develop a polymerase chain reaction (PCR) protocol for the detection of Salmonella in artificially contaminated chicken meat. Tests were performed with different dilutions of Salmonella Typhimurium or Salmonella Enteritidis cells (10-7, 10-8 or 10-9 CFU/mL) inoculated in chicken meat samples, in order to establish the limits of detection, incubation times (0, 6, 8 and 24 hours of pre-enrichment in PBW 1 percent) and three DNA extraction protocols (phenol-chloroform, thermal treatment and thermal treatment and Sephaglass). The assay was able to detect until 10-9 CFU/mL of initial dilution of Salmonella cells inoculated in chicken meat, which allows detection of Salmonella within 48 hours, including 24 hours of pre-enrichment and using the phenol-chloroform DNA extraction protocol. As the results are obtained in a shorter time period than that of microbiological culture, this procedure will be useful in the methodology for detection of Salmonella in chicken

Métodos de extraçäo de DNA para a detecçäo de Salmonella em ovos de galinhas, com e sem casca, através da reaçäo em cadeia pela polimerase / DNA extraction methods for Salmonella detection in chicken eggs, inshel and outshel, by polimerase chain reaction

O diagnóstico microbiológico de Salmonella sp em amostras de alimentos é demorado, com cinco diferentes etapas, levando cerca de 120 horas até o resultado final. A utilizaçäo da técnica da Reaçäo em Cadeia pela Polimerase (PCR) pode diminuir esse período, porém sofre influência de substâncias presentes na amostra que afetam a reaçäo. O objetivo deste trabalho foi comparar dois métodos de extraçäo de DNA, a extraçäo por tratamento térmico e a pelo fenol-clorofórmio, em amostras de 100 ovos de galinhas domésticas artificialmente contaminados com uma cepa de Salmonella enterica sorovar typhimurium em fase estacionária. O material obtido com as extraçöes foi submetido à PCR, utilizando-se um par de iniciadores que amplificam um fragmento de 284pb do gene InvA de Salmonella sp. Comparando os métodos de extraçäo, observou-se uma diferença na capacidade de detecçäo de 12 por cento a favor do método do fenol-clorofórnio, quando a extraçäo foi realizada a partir do ovo com casca. No momento em que a mesma metodologia foi usada apenas com a parte interna dos ovos, essa diferença subiu para 26 por cento o que foi significativo (P<0,003), demonstrando que a metologia de extraçäo foi determinante para melhorar a sensibilidade da técnica. No entanto, ao comparar-se a percentagem de positivos independente da técnica de extraçäo do DNA, observou-se diferença significativa (P<0,047) a favor das amostras de ovos sem casca. Isso sugere que para a detecçäo de Salmonella por PCR deve-se utilizar apenas a parte interna dos ovos, pois a casca pode determinar interferência na técnica.

Detecçäo de Salmonella sp em ovos de galinhas através da reaçäo em cadeia pela polimerase-PCR / Detection of Salmonella in chicken eggs through the techinique of PCR

Estimativas brasileiras citam 34.000 pessoas anualmente envolvidas em surtos de toxinfecçöes alimentares causadas por Salmonella sp. Com freqüência säo indicados como fonte de infecçäo ovos ou produtos derivados como cremes, maionese e clara batida fresca. Tendo em vista dificuldades de confirmaçäo da presença destes microrganismos nestes alimentos, buscam-se alternativas de diagnóstico, entre elas a utilizaçäo da Biologia Molecular. Através da reaçäo em cadeia pela polimerase (PCR), utilizando-se um par de oligonucleotídios que amplifica um fragmento de 284 pares de bases do gene invA (gene relacionado com a capacidade de invasäo das salmonelas), foi possível detectar a presença destas em ovos SPF contaminados experimentalmente com uma amostra de Salmonella Typhimurium que foi coletada a partir de um cultivo em meio BHI, na fase estacionária, diluída até 0,00000001 e inoculada em ovos de galinha inteiros e apenas na parte interna. Vinte e cinco gramas de ovos contaminados foram incubados a 42§C com 225 ml de água peptonada a 1 por cento. Para a extraçäo de DNA e a realizaçäo da PCR coletou-se 1ml de cada amostra, em diferentes tempos de incubaçäo em água peptonada a 1 por cento e em caldo Rappaport-Vassiliadis. As metodologias de extraçäo obedecereram protocolo do fenol-clorofórmio e pelo tratamento térmico. Obteve-se 100 por cento de recuperaçäo nas amostras com 24 horas de incubaçäo em água peptonada a 1 por cento, o mesmo acontencendo com 24 horas de caldo RV, independentemente do inóculo inicial.