RESUMO
O vírus Dengue (DENV) codifica uma poliproteína que é clivada em três proteínas estruturais (capsídeo,envelope e membrana) e sete proteínas não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3,NS4A, NS4B e NS5). Durante a infecção viral, a NS1 é encontrada no interior de células hospedeiras, associada à membrana plasmática e também secretada para a circulação como um multímero solúvel. [...] Considerando que o fígado é normalmente afetado pela infecção por DENV, este trabalho teve como objetivo estudar o efeito da expressão isolada da proteína NS1 em células de hepatocarcinoma humano,HepG2. Anteriormente, foram construídos em nosso laboratório plasmídeos contendo ogene ns1: pcENS1, que codifica a região C-terminal da proteína E (peptídeo sinal da proteína NS1) e NS1; pcENS1ANC, similar ao pcENS1 com a adição da porção Nterminalda NS2A (ANC), importante para a associação da NS1 à membrana plasmática; e pcTPANS1, que contém a sequência que codifica o peptídeo sinal do ativador de plasminogênio de tecido humano (t-PA) fusionada à sequência NS1. Neste trabalho, nós inicialmente padronizamos um protocolo de transfecção eficiente para aHepG2, utilizando o plasmídeo pcENS1. Avaliamos três métodos de transfecção distintos: com os lipossomos Lipofectamina e FuGENE 6, e a eletroporação no aparelho NucleofectorTM. A produção da NS1 recombinante foi detectada e quantificada por imunofluorescência e citometria de fluxo...
The dengue virus (DENV) encodes a polyprotein,which is cleaved in three structural proteins (capsid, envelope and membrane) and sevennon-structural proteins (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B and NS5). During virusinfection, the NS1 is found inside host cells, associated with cell plasma membrane andalso secreted into the circulation as a soluble multimer. [...] Considering that the liver is normally affected by DENV infection, thiswork aimed to study the effect of isolated expression of the NS1 protein in humanhepatocellular carcinoma cells, HepG2. Previously, plasmids containing the ns1 genesequence were constructed in our laboratory: pcENS1, which encodes the C-terminalend of E protein (signal peptide of NS1 protein) and the NS1; pcENS1ANC, similar topcENS1 with the addition of the N-terminal portion of NS2A (ANC), important for NS1association with the plasma membrane; and pcTPANS1, encoding the human tissueplasminogen activator signal sequence (t-PA) fused to the NS1 sequence. In this work,we initially standardized an efficient protocol of HepG2 transfection, using the plasmidpcENS1. We evaluated three different transfection methods: with the liposomesLipofectamine and FuGENE 6 and the electroporation in NucleofectorTM Device. Therecombinant NS1 production was detected and quantified by immunofluorescence andflow cytometry. We observed a reduced number of cells producing NS1 in transfectionswith Lipofectamine (3.9 percent), and FuGENE 6 (6.8 percent)...