Caracterización molecular y resistencia antimicrobiana de aislamientos de Clostridium perfringens de diferentes orígenes en Costa Rica

Molecular characterization and antimicrobial resistance of Clostridium perfringens isolates of different origins from Costa Rica. Clostridium perfringens, a Gram positive, spore-forming anaerobe, is widely distributed in nature. Based upon their production of four major toxins α, β, ε and ι, C. perfringens is classified into five toxinotypes (A-E). Some strains produce an enterotoxin (CPE), encoded by the cpe gene, which causes diarrhea in humans and some animals. C. perfringens strains that had been previously isolated and been kept at -80°C were analyzed for the presence of toxin genes and for antimicrobial resistance: 20 from soils,20 from animal, 20 from human origin and 21 from food non related to outbreaks. According to PCR results, all strains were classified as C. perfringens type A, since only α toxin gene was detected, while cpe was detected in two strains (2.5%) isolated from food, as it has been described in other world regions. Antibiotic resistance to at least one antibiotic was detected in 44% of the strains, 41% was resistant to clindamycin, 25% to chloramphenicol, 22% to penicillin and 20% to metronidazole. Soils strains showed the highest resistance percentages to almost all antibiotics. Multiresistance (to three or more antibiotic groups) was detected in the strains from soil (40%), human origin (30%), food (14%) and animal origin (5%). The high resistance rates found may be explained by the widespread use of antimicrobials as growth promoters in plants and animals; also these resistant strains may act as reservoir of resistance genes that may be transferred between bacteria in different environments. Rev. Biol. Trop. 59 (4): 1479-1485. Epub 2011 December 01.

Clostridium perfringens es un bacilo Gram positivo, esporulado, anaerobio, ampliamente distribuido en la naturaleza, que produce cuatro toxinas principales α, β, ε y ι, las cuales permiten su clasificación en cinco toxinotipos (A-E). Algunas cepas producen una enterotoxina (CPE), codificada por el gen cpe, que causa diarrea en seres humanos y en algunos animales. La presencia de los genes de estas toxinas y la sensibilidad a los antibióticos se determinó en 81 cepas de C. perfringens previamente aisladas y que habían sido mantenidas a -80°C; 20 de suelos, 20 de origen animal, 20 de origen humano y 21 de alimentos cocidos no relacionados con brotes alimentarios. De acuerdo con los resultados de PCR, todas las cepas fueron clasificadas como C. perfringens tipo A, debido a que solo se les detectó el gen de la toxina α, mientras que el gen de la enterotoxina (cpe) se detectó en dos cepas (2.5%) aisladas de alimentos, tal como ha sido descrito en otras regiones del mundo. El 44% de las cepas fue resistente a algún antibiótico; clindamicina (41%), cloranfenicol (25%), penicilina (22%) y metronidazol (20%). En general, las cepas provenientes de suelos presentaron los mayores porcentajes de resistencia a casi todos los antibióticos. El 40% de las cepas de suelo presentó multiresistencia (a tres o más grupos de antibióticos), el 30% de las de origen humano, el 14% de las de alimentos y el 5% de las de origen animal. Las altas tasas de resistencia encontradas podrían deberse al amplio uso de antibióticos como promotores de crecimiento de plantas y animales y esas cepas resistentes podrían actuar como reservorio de genes de resistencia que pueden transferirse entre bacterias de diversos ambientes.

Evaluación microbiológica de alimentos listos para consumo procesados por pequeñas industrias costarricenses / Microbiological evaluation of ready-to-eat foods manufactured by small Costa Rican industries

Los alimentos listos para su consumo (ALC) son alimentos procesados que pueden consumirse sin ningún tratamiento térmico adicional, lo que ha incrementado su popularidad. El objetivo de este estudio fue determinar la inocuidad y calidad microbiológica de 90 ALC producidos por pequeñas industrias costarricenses, con el fin de evaluar el riesgo para la salud pública. Se analizaron 26 encurtidos, 18 aderezos, 18 ensaladas, 12 dulces en conserva y 16 antipastos. A cada muestra se le determinó el pH y la presencia por cultivo de indicadores de calidad microbiológica y de patógenos (Salmonella, Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens, C. botulinum y Bacillus cereus); además, se investigó por PCR la presencia de genes que codifican por las toxinas de C. botulinum y C. perfringens. Un 37% de las muestras tuvo un nivel de acidez que podría permitir la proliferación de patógenos (pH >4.5). En general, los indicadores de vida útil fueron aceptables, siempre y cuando los ALC se mantengan en condiciones de temperatura y humedad adecuadas. Un 64% de las muestras presentó valores de coliformes totales que sugieren mala higiene en su elaboración (NMP/g >1000), que se confirma con el hallazgo de coliformes fecales en el 56% y que las hace inaceptables para el consumo humano. Todos los cultivos para patógenos fueron negativos, excepto cuatro para B. cereus. No se detectaron toxinas de C. botulinum y solo una muestra fue positiva para el PCR de C. perfringens. Este estudio evidencia una importante contaminación fecal en ALC, una situación indeseable y totalmente prevenible si se practican técnicas adecuadas de manejo de alimentos, de higiene y se presta mayor atención a los puntos críticos de control.

Ready-to-eat (RTE) foods are processed foodstuffs which have gained popularity in recent times because they can be ingested without further thermic treatments. In this work, the microbiological quality and safety of 90 samples of RTE foods manufactured by small Costa Rican industries was determined to evaluate whether they represent a Public Health risk. Twenty-six samples of pickled vegetables, 18 dips, 18 salads, and 12 sweet treats were studied. Each sample was analyzed with regard to its pH, the presence of culturable microbiological quality indicators and recognized foodborne pathogens (Salmonella, Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens, C. botulinum, and Bacillus cereus) Selected genes encoding toxins of C. botulinum and C. perfringens were screened by PCR. Thirty-seven percent of the samples had a level of acidity that could allow the growth and proliferation of bacterial pathogens (pH >4.5). The shelf-life indicators were acceptable but only if the RTE foods are kept at adequate conditions of temperature and humidity. Sixty-four percent of the RTE foods had total coliforms values that evidence inadequate hygiene practices during its elaboration (MPN/g >1000). This result was confirmed by the finding of fecal coliforms in 56 % of the samples, which, by the way, are inacceptable for human consumption. All cultures for pathogens were negative, except for 4 samples that contained B. cereus. Toxins of C. botulinum were not detected and one single sample was positive for the PCR for C. perfringens. The elevated degree of fecal contamination detected in the RTE could be prevented by means of good manufacturing practices, better hygiene measures and a deeper attention to critical control points.

Bacterial contamination of automotive fuels in a tropical region: the case of Costa Rica

Microbial contamination of fuel has been the cause of several problems in transportation and storage of these products. Due to the lack of previous studies related to these problems in Costa Rica, bacterial quality was evaluated biannually in automotive fuels stored in the four oil distribution facilities of the Costa Rican Petroleum Refinery (RECOPE). In 12 oil storage tanks, for a total of 96 samples, mesophilic, heterotrophic aerobic/facultative counts (ASTM D6974-04) and identification of bacteria presented in regular gas, premium gas and diesel from the bottom and superior part of the tanks were done; in the samples containing an aqueous phase, sulfate reducing bacteria (SRB) were also quantified by the most probable number technique (MPN), according to the ASTM D4412-84 standard. The higher contamination was shown at the bottom of the tanks (populations up to 10(4) UFC/l), especially if there was accumulated water, in which case populations reached 10(8) UFC/l. The most contaminated fuel was diesel (counts up to 10(4) UFC/l), whereas the less contaminated was premium gas. The less contaminated fuels were from the facilities of La Garita and Barranca, whereas the most contaminated were from Ochomogo. Nevertheless, the quantified populations did not cause significant alteration in quality physicochemical parameters in the samples analyzed. A total of 149 bacterial strains were isolated, 136 (91.3%) Gram positive and 13 (8.7%) Gram negative. The most frequent genera were Staphylococcus (24.0%), Micrococcus (21.9%), Bacillus (18.8%) and Kocuria (11.5%) among Gram positive bacteria and Pseudomonas (7.3%) among Gram negative bacteria. The majority of these genera have been found as fuel contaminants or even as degraders of this kind of products; nevertheless, some species for which their appearance or growth in hydrocarbons have not been described were found with low frequencies. SRB were present in counts up to 10(5) MPN/l in 42.9% of water containing samples (including all from diesel tanks), indicating biocorrosion processes risk in fuel transport and storage systems. From the findings in this study it is recommended to give a frequent maintenance to fuel containers, based on continuous drainage and removal of accumulated water, antimicrobial agent addition and microbial quality monitoring in country’s fuels. Rev. Biol. Trop. 57 (3): 489-504. Epub 2009 September 30.

Se evaluó semestralmente durante dos años la calidad bacteriana de los combustibles almacenados en los cuatro planteles de la Refinadora Costarricense de Petróleo (Costa Rica). Para un total de 96 muestras se realizaron recuentos (norma ASTM D6974-04) e identificación de las bacterias presentes en gasolina regular, gasolina súper y diesel en los niveles superior e inferior de los tanques contenedores; en las muestras con fase acuosa se cuantificaron las bacterias reductoras de sulfato (SRB, norma ASTM D4412-84). La mayor contaminación se observó en el fondo de los tanques, sobretodo si se presentó una capa de agua almacenada. El diesel fue el combustible más contaminado, sin embargo, no se observó alteración importante en los parámetros fisicoquímicos de las muestras evaluadas. Se aislaron 149 cepas, 136 (91.3%) Gram positivas y 13 (8.7%) Gram negativas; los géneros más frecuentes fueron Staphylococcus (24.0%), Micrococcus (21.9%), Bacillus (18.8%), Kocuria (11.5%) y Pseudomonas (7.3%). Con bajas frecuencias se encontraron algunas especies para las que no se ha descrito su aparición o crecimiento en hidrocarburos. Las SRB se presentaron con recuentos de hasta 105 MPN/l en un 42.9% de las muestras con agua residual, principalmente en diesel, lo cual es indicativo de alerta por biocorrosión. A partir de los resultados se recomienda dar un mantenimiento frecuente a los contenedores, la adición de compuestos antimicrobianos y el monitoreo de la calidad microbiana de los combustibles del país.

Bacterias anaerobias como agentes etiológicos de infecciones intraabdominales en un hospital de Costa Rica / Anaerobic bacteria as etiological agents of intraabdominal infections from a Costa Rican hospital

Las infecciones intraabdominales son condiciones muy serias que representan un peligro para la vida del paciente, producidas por microflora endógena del tracto gastrointestinal. Aunque el estudio de bacterias anaerobias es importante para el tratamiento de estas infecciones, en Costa Rica y en otros países latinoamericanos, pocos laboratorios lo realizan. Objetivo: Analizar la etiología anaerobia de las infecciones intraabdominales de pacientes de un hospital de adultos en Costa Rica, durante el período de 1999 al 2007. Materiales y métodos: Se investigó la presencia de bacterias anaerobias en 231 muestras de origen intraabdominal. Estas fueron tomadas por personal médico del hospital y transportadas, en anaerobiosis, hasta el Laboratorio de Investigación en Bacteriología Anaerobia. Allí se inocularon en medios prerreducidos y se subcultivaron en anaerobiosis en agar sangre suplementado. Se seleccionaron los morfotipos coloniales anaerobios, se les realizó tinción de Gram, determinación de fluorescencia, producción de pigmento y de hemólisis. La identificación definitiva se completó con el sistema RapID 32A® (bioMérieux). Resultados y conclusiones: Se aislaron 265 cepas de bacterias anaerobias a partir de 129 muestras positivas (56%): 71% Gram positivos y 29% Gram negativos, para un promedio de 2.1 aislamientos anaerobios por muestra. Bacteroides fue el género más frecuente (22%), seguido de Eggerthella y Clostridium (16 y 15%). El grupo B. fragilis fue el más frecuente en todos los tipos de muestras intraabdominales analizadas. Debido a que el conocimiento de los agentes etiológicos involucrados contribuye al éxito terapéutico en las infecciones intraabdominales, el estudio por bacterias anaerobias es recomendable no solo en los hospitales costarricenses, sino también en la región latinoamericana.

Un método sencillo para generar anaerobiosis en tubos de cultivo / A simple method to achieve anaerobiosis in culture media tubes

Introducción. El cultivo de bacterias anaerobias requiere una atmósfera libre de oxígeno, por lo cual, a pesar de la gran importancia clínica de los anaerobios, el diagnóstico usualmente es sólo microscópico. En este estudio se propone y evalúa un método para preparar tubos de medio de cultivo libres de oxígeno, sencillo, económico y al alcance de cualquier laboratorio. Material y métodos. La atmósfera anaerobia se logra durante el proceso de autoclavado y descompresión rápida de los tubos a los que se le ha incorporado un tapón de hule, tapa de rosca y una aguja a través de la cual se elimina la atmósfera aerobia. Para evaluar la efectividad de estos medios se crecieron 45 especies de clostridium y 12 especies de los géneros Bifidobacterium, acteroides, Lactobacillus, Propionibacterium y Actinomyces, (hasta completar 80 cepas), en tubos anaeróbios prerreducidos antes de esterilizar (PRAS) y en tubos preparados de acuerdo con el método propuesto. Resultados. Las 80 cepas de bacterias anaerobias crecieron en los tubos prerreducidos y sin prerreducir, no hubo diferencias en los grados de turbiedad. Discusión. El método propuesto para generar anaerobiosis en los tubos de cultivo es una posibilidad al alcance a cualquier laboratorio de bacteriología, para mejorar el diagnóstico, mediante cultivo, de infecciones por bacterias anaerobias

Efecto inhibitorio de clostridium perfringens sobre C. botulinum en muestras de suelo / Inhibitory effect of Clostridium perfringens on C. botulinum in soil samples

Introducción. La frecuencia de aislamiento de Clostridium botulinum en Costa Rica y en otros sitios es baja, en tanto que C. perfringens es la especie toxigénia más abundante en la naturaleza. Se ha descrito que C. perfringens podría impedir el aislamiento de C. botulinum o la producción de su toxina a partir de muestras de suelo, razón por la cual se pensó en investigar el efecto al respecto, de cepas de C. perfringens aisladas de suelos costarricenses. Material y Métodos. Se analizaron 38 cepas de C. perfringens obtenidas de suelos costarricenses para demostra si los sobrenadantes de cultivo inhibían el crecimiento de C. botulinum A (ATCC 19399). Además, se realizaron cultivos mixtos de C. botulinum y C. perfringens para evaluar si se impedía el crecimiento y la producción de toxina botulínica. Resultados. El 58 por ciento de las cepas de C. perfringens tuvo efecto inhibitorio sobre el crecimiento de C. botulinum; al menos dos cepas inhibían totalmente el efecto de la toxina botulínica en los cultivos mixtos aún cuando se demostró la presencia de células viables de C. botulinum. El número mínimo de células de C. perfringens necesarias para lograr lo anterior fue de 10 a la octava células. Conclusión. Es posible que la presencia de C. perfringens limite el aislamiento o demostración de C. botulinum en suelos costarricenses. Se requiere investigar si las cepas nativas de C. perfringens tienen efecto sobre otras cepas y otros grupos de C. botulinum