Lipolytic capacity of Pseudomonas spp. isolated from refrigerated raw milk / Capacidade lipolítica de Pseudomonas spp. isoladas de leite cru refrigerado

The psychrotrophic bacteria growth in refrigerated milk is responsible for the production of heat resistant enzymes, including those which have lipolytic capacity. Lipases can cause rancidity and off-flavor in pasteurized and UHT milk, milk powder and cheese. Pseudomonas spp. is the major genera responsible by lipases synthesis, mainly Pseudomonas fluorescens. The lipolytic capacity of Pseudomonas spp. (1182 strains) and P. fluorescens (158 strains) isolated from cooling tank and bulk milk transportation were tested. Pseudomonas spp. strains were isolated by Pseudomonas Agar Base, adding the supplement cephalotin, fusidic acid, cetrimide- CFC (30º C/48 h) and Pseudomonas Cetrimide Agar with 10% of glicerol (21º C/ 48 h) to determine P. fluorescens. The strains lipolytic capacity were tested with Tributyrin Agar (21 oC/72 h). Lipolytic indexes of Pseudomonas spp. were 51.4% and 67.2% in cooling tank and bulk milk transportation (p< 0.05), respectively. P. fluorescens lipolytic capacity indexes were 26.4% from strains isolated from cooling tank and 41% (p < 0.05) from strains isolated from bulk milk transportation. High lipolytic indexes had been found in the strains isolated from refrigerated raw milk sent to manufacturing. Refrigeration temperature and storage time may contribute to the difference observed between two points of collection evaluated in this study.

A multiplicação de bactérias psicrotróficas em leite refrigerado pode promover a síntese de enzimas resistentes ao calor, entre elas aquelas que tem capacidade lipolítica. As lipases podem promover rancidez, e defeitos de sabor em leite pasteurizado, UHT, leite em pós e queijos. Pseudomonas spp. é o principal gênero responsável pela síntese desta enzimas, principalmente a espécie Pseudomonas fluorescens. Avaliou-se a capacidade lipolítica de 1182 cepas de Pseudomonas spp. e 158 cepas de P. fluorescens isoladas de amostras de leite de tanques de resfriamento (TR) e caminhão tanque (CT) enviado ao beneficiamento. Foi utilizado o Agar base Pseudomonas com suplemento cephalotin, fusidic acid, cetrimide - CFC (30º C/48 h ) para isolamento das pseudomonas e Pseudomonas Cetrimide Agar com 10% de glicerol (21º C/ 48 h) para a espécie P. fluorescens. Para avaliação da capacidade lipolítica as cepas fora semeadas em Ágar Tributirina (21 ºC/72 h). O índice de lipólise das cepas de Pseudomonas spp. provenientes do leite do tanque de resfriamento e do caminhão tanque (p<0,05) foram de 51,4% e 62,7%, respectivamente. Foram também observados índices de capacidade lipolítica de P. fluorescens de 26,4% e 41% (p<0,05) para TR e CT, respectivamente. Altos índices de cepas lipolíticas foram encontrados nas cepas isoladas do leite cru refrigerado enviado ao beneficiamento. Temperatura de refrigeração e tempo de estocagem podem ter contribuído para a diferença observada na população lipolítica dos dois pontos de coleta avaliados.

Pseudomonas spp. and P. fluorescens: population in refrigerated raw milk / Pseudomonas spp. e P. fluorescens: população em leite cru refrigerado

ABSTRACT: Raw milk samples were collected from cooling tanks (after they cooled for 48 h) in five dairy farms and the corresponding bulk tank (bulk milk transportation, BMT) when they arrived to the industry. Routine physical chemical analyzes and quantification of psychrotrophic ( Pseudomonas spp. and P. fluorescens ) and aerobic mesophilic (AM) populations were performed. Only relative density and titratable acidity values for samples of milk from three farms were in agreement to the quality parameters required by law. In the BMT, only the protein content has not reached the minimum value established by law, and counting was performed for AM (>105 colony forming units (CFU) mL-1) and psychrotrophic bacteria (2.8x106CFU mL-1). Pseudomonas spp. counting corresponded to 17.9% of the psychrotrophic population, and P. fluorescens was 3.4% of Pseudomonas spp . count. In milk samples from dairy farms, counts were variable for AM (3.4x105 to 3.7 x107CFU mL-1), psychrotrophic (4.0x104 to 3.1x106CFU mL-1), Pseudomonas spp. (2.3x104 to 1.8x105CFU mL-1), and P. fluorescens (62 to 8.4x103CFU mL-1). For the populations studied, no statistical difference (P>0.05) was observed between counts reported in milk samples collected in dairy farms (cooling tanks) and BMT. Therefore, the genera Pseudomonas spp. and P. fluorescens were not the most frequent psychrotrophic bacteria in this studied milk transportation line.

RESUMO: Amostras de leite foram coletadas de tanques de refrigeração (após 48h de refrigeração) em cinco fazendas de produção e do respectivo caminhão tanque (leite de conjunto, LC) ao chegar à indústria beneficiadora. Análises físico químicas de rotina e quantificação das populações de bactérias psicrotróficas ( Pseudomonas spp. e P. fluorescens ) e aeróbios mesófilos (AM) foram realizadas. Apenas os valores de densidade relativa e acidez titulável de amostras de leite de três fazendas estavam de acordo com a legislação. No LC, apenas o teor de proteína não atingiu o valor mínimo estabelecido por lei, e a contagem foi realizada para AM (>105 unidades formadoras de colônias (UFC) mL-1) e psicrotróficos (2,8x106UFC mL-1). A contagem de Pseudomonas spp. correspondeu a 17,9% da população de psicrotróficos, e 3,4% da contagem de Pseudomonas spp. eram da espécie P. fluorescens . Nas amostras de leite das fazendas de produtoras, as contagens foram variáveis para AM (3,4x105a 3,7x107UFC mL-1), psicrotróficos (4,0x104 a 3,1x106UFC mL-1), Pseudomonas spp. (2,3x104 a 1,8x105UFC mL-1) e P. fluorescens (62 a 8,4x103UFC mL-1). Para as populações estudadas, nenhuma diferença estatística (P>0,05) foi observada entre as contagens encontradas nas amostras de leite coletadas nas fazendas (tanques de resfriamento) e do LC. Portanto, o gênero Pseudomonas spp. e a espécie P. fluorescens não foram os psicrotróficos mais frequentes nesta linha de transporte de leite estudada.

Qualidade microbiológica de produtos cárneos e lácteos comercializados em feiras livres de Arapongas-PR / Microbiological quality of meat and dairy products commercialized at street markets in Arapongas-PR

Foram avaliados queijos Minas frescal, leite in natura, embutidos frescais e carne de ave in natura de feiras livres da cidade de Arapongas-PR. Os produtos foram avaliados microbiologicamente e caracterizados através da aplicação de um questionário estruturado, objetivando determinar suas condições higiênico-sanitárias de comercialização. Nos produtos cárneos, foram realizadas pesquisa de Salmonella spp. e contagens de Staphylococcus aureus, coliformes a 35 ºC e E. coli. Para os queijos Minas frescal e o leite in natura foram realizadas contagens de coliformes a 35 ºC e E. coli, e contagem de micro-organismos aeróbios mesófilos para o leite. Os comerciantes trabalhavam de forma informal; não tinham conhecimento adequado para produção, manipulação e conservação dos produtos comercializados; grande parte dos alimentos comercializados era de produção própria e sem fiscalização; as condições higiênico-sanitárias não eram adequadas. Foram encontradas altas contagens de coliformes a 35 ºC, E. coli e bactérias aeróbias mesófilas nos produtos lácteos. Entre os produtos cárneos as maiores contagens de coliformes a 35ºC, E. coli e S. aureus foram nos embutidos frescais. Salmonella spp. foi encontrada nos produtos cárneos. A presença e/ou altas contagens dos indicadores de qualidade pesquisados foram indicativos de falhas nas boas práticas de manipulação e na higiene de produção dos produtos avaliados. As condições inadequadas de produção e comercialização dos produtos comercializados e a falta de conhecimento técnico adequado dos feirantes contribuíram diretamente para as contagens microbiológicas inaceitáveis encontradas.

Minas Frescal cheese, raw milk, fresh sausages and raw chicken meat in street markets of Arapongas-PR were evaluated. The products were analyzed microbiologically aimed to evaluate the sanitary conditions through the application of a structuralized questionnaire. Salmonella spp., Staphylococcus aureus, coliforms at 35 °C and E. coli counts were carried out on the meat products. Coliforms at 35 °C and E. coli counts were performed on Minas Frescal cheese and milk, as well as aerobic mesophilic microorganisms count on milk. Sellers were informal workers, with no appropriate knowledge about production, handling and preservation of the marketed products. In addition, most of the products were homemade without any legal inspection, and the sanitary conditions were inappropriate. High counts of E. coli, coliforms at 35 °C and aerobic mesophilic bacteria were found in the dairy products. Among the meat products, the highest counts of coliforms at 35 °C, E. coli and S. aureus were found in the fresh sausages. Salmonella spp. was found in the meat products. The presence and/or high counts of microbiology quality indicators were indicative of failures in good handling practices. Inappropriate production and marketing conditions and the lack of technical knowledge contributed directly to the unacceptable microbiological counts found in this study.

Qualidade microbiológica do leite cru e pasteurizado produzido no Brasil: revisão / Microbiological quality of milk produced in Brazil: review

A realização do processo de higienização e controle microbiológico dos contaminantes presentes no leite em toda sua cadeia de produção e distribuição, bem como de seus derivados, são fatores fundamentais para a obtenção de produtos com qualidade. Dessa forma, o risco de aparecimento de doenças causadas por micro-organismos patogênicos ou por suas toxinas quando presentes nesses produtos pode ser evitado, garantindo dessa maneira, a saúde dos consumidores. Além disso, tais medidas de controle evitam a perda da produção. A presença destes micro-organismos e/ou suas toxinas, bem como outros metabólitos como enzimas, resulta em alterações nas características físico-químicas e microbiológicas do leite e seus derivados. Tais alterações ocorrem do momento da ordenha até o beneficiamento do leite pela indústria. No Brasil, no ano de 2002, o Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento criou e implantou a Instrução Normativa nº 51, objetivando regulamentar as normas para produção do leite no país e a obtenção de produtos com melhor qualidade. Deste modo, esta revisão descreve aspectos importantes relacionados à qualidade microbiológica do leite, enfocando os possíveis grupos de contaminantes encontrados neste produto. Além disso, são apresentados e discutidos diversos estudos realizados com foco na qualidade microbiológica do leite produzido em diferentes regiões do Brasil, frente ao preconizado pela referida legislação.

The control of contaminants from milk and hygiene process during the whole chain of production and distribution of milk, as well as milk products are important factors to obtain products with high quality. Also, these procedures can help to avoid the risk of diseases caused by microorganisms and/or their toxins which can be found in these products. Also, the strict control of these parameters avoids losses in milk production. The presence of pathogenic microorganisms and/or their toxins alters physical-chemical and microbiological characteristics of milk and derived as cheese and yogurt. These alterations occur from milking until milk processing at the dairy industry. In Brazil, the Instrução Normativa nº 51 was created in 2002 aiming to regulate standards for milk production in the country and obtain products with high quality. Thus, this review describes important aspects related to microbiological quality of milk, highlighting the groups of microorganisms contaminants found in this product. Moreover, studies about microbiological quality of milk produced in several Brazilian?s states are discussed with focus on cited legislation.

Estafilococos: morfologia das colônias, produção de coagulase e enterotoxina a, em amostras isoladas de leite cru refrigerado / Staphylococci: colonies morphological caracteristics, coagulase and EEA production colected from cooled raw milk samples

Os relatos de intoxicação estafilocócica, principalmente por S. aureus, são frequentemente associados à ingestão de 100ng de enterotoxina/g ou mL de alimento. A produção de enterotoxina pelos estafilococos está associada fortemente à produção de coagulase. Neste trabalho foram avaliadas amostras de leite de 51 propriedades leiteiras em Londrina e 50 em Pelotas (RS). Todas as 101 amostras apresentaram contagens de estafilococos coagulase positivos (ECO). Das 552 colônias avaliadas, 256 foram coagulase positivas e destas cerca de 60 eram típicas no àgar Baird Parker e, em média, 60 do total de 296 estafilococos coagulase negativos (ECN) eram colônias atípicas. Quanto à capacidade enterotoxigênica, testou-se 109 colônias ECP, sendo 5,5 (6) positivas e 18 ECN, sendo 1 (5,5) positiva. Assim, a freqüência de ECN produtores de EEA (5,5) foi semelhante a dos ECO. Conlui-se que há extensa contaminação do leite cru por ECP, sendo grande parte (40) das colônias atípicas produtoras de coagulase.

The stories of food poisoning from staphylococci, mainly by S. aureus, are frequently associates to theingestion of food with 100 ng of enterotoxin/g or mL. The production of enterotoxin using staphylococciis strongly associated with the production of coagulase. In this paper, milk samples of 51 milk propertiesin Londrina (RS) and 50 in Pelotas had been evaluated. All the 101 samples had presented counts ofcoagulase positive staphylococci (CPS). From 552 colonies studied, 256 were CPS where 60% of thecolonies were typical in Baird Parker agar and, from 296 coagulase negative staphylococcus (CNS), inmean, 60% were atypical colonies. Due to the enterotoxigenic capacity, were tested 109 CPS, being 5,5%(6) positive and 18 CNS where 1 (5,5%) were positive. The frequency of CPS EEA (5,5%) producer wassimilar of the CNS. There is a wide milk contamination with CPS, where, a big part (40%) of the atypicalcolonies is coagulase producers

Utilização de plasma de cavalo no teste de coagulase em Estafilococos isolados de leite cru / utilization of horse plasma in coagulase test for Staphylococci isolated from raw milk

Estafilococos têm grande importância na indústria de alimentos por serem associados a surtos de intoxicação alimentar, pela ação de suas exterotoxinas. A produção dessas substâncias tem alta correlação com a produção da enzima coagulase, que é detectada na identificação de cepas potencialmente patogênicas. Esse teste é tradicionalmente realizado com plasma de coelho liofilizado ou pela sua separação de sangue coletado de coelhos. O plasma liofilizado tem alto custo e a punção cardíaca, além de ser bastante cruenta, permite aobtenção apenas de pequenos volumes de material. Este trabalho tem como objetivo verificar a viabilidade da utilização de um material alternativo ao plasma de coelho, neste caso o plasma de cavalo, no teste de coagulase para estafilococos isolados de leite cru. Assim, 410 colônias típicas e atípicas de estafilococos isolados de leite cru foram submetidas ao teste de coagulase utilizando-se dois plasmas. Os resultados identificaram 284 (69,26 por cento) colônias coagulase positivas e 126 (30,73 por cento) coagulase negativas, com concordância de 100 por cento entre os dois plasmas. Os resultados obtidos indicam que a utilização do plasma de cavalo pode ser uma alternativa viável na pesquisa de estafilococos coagulase positivos em leite cru.

Assessment of the efficiency of SimPlate tm total plate count color indicator (TPC CI) to quantify mesophilic aerobic microorganisms in pasteurized milk

The SimPlate (tm) TPC CI system is a rapid method to count mesophilic aerobic microorganisms (MAM) in foods, based on the use of resazurine to indicate bacterial growth. Its efficiency in pasteurized milk was evaluated using 142 pasteurized milk samples (38 type A, 43 type B and 61 type C) collected in Londrina, PR. The standard plating method, using Plate Count Agar (PCA) was used for comparison. The plates of both systems were incubated at 35§C and read after 24h and 48h. The occurrence of false-positive and false-negative wells and the predominant microorganisms in them were also evaluated. The results were compared by simple correlation and mean variance analyses. The correlation (r) and mean variance values were 0.6811 and 0.7583 for the results obtained after 24h, respectively, and 0.9126 and 0.0842 for the results obtained after 48h, respectively. These results indicate that the performance of the system increases when the plates are incubated for 48h. When the three types of milk were evaluated separately, these values were 0.9285 and 0.0817 for type A milk, 0.9231 and 0.0466 for type B milk and 0.7209 and 0.1082 for type C milk. These results indicate that the better the quality of the milk the better the performance of SimPlate (tm) TPC CI. False-negative wells, found more frequently in samples with high MAM counts, were caused by Gram positive microorganisms, poorly detected by the SimPlate (tm) TPC CI system because they grew slowly and had low reduction capacity. The results indicated a higher efficiency of the SimPlate (tm) TPC CI system in the reading at 48h.

Use of readycult (tm) - LMX for enumeration of total coliforms and Escherichia coli in milk

Readycult (tm) - LMX is a rapid method to test for the presence of total coliform bacteria and Escherichia coli in water, giving results in 24h. It is based on reactions of specific microbial enzymes or indicator nutrients of the medium. The goal of this paper was to study the use of Readycult (tm) - LMX to detect total coliform and E. coli in milk. One hundred twenty five samples of pasteurized and raw milk, collected in Londrina, PR, Brazil, were tested simultaneously by the most probable number (MPN) method using Brilliant Green Bile Lactose Broth (2 per cente) (BRILA) and Readycult (tm) - LMX. The Readycult (tm) - LMX test was evaluated for sensitivity, simplicity, and speed of results. There was a significant correlation between the results obtained by the two methods for total coliforms (r: 0.8224) and for E. coli (r: 0.8603). The two methods yielded similar results, but Readycult (tm) - LMX was easier to use. In addition, results were available as early as 24h.

Microrganismos psicrotróficos em leite / Psychrotrophs microorganisms in milk

Os psicotróficos säo relatados como microrganismos de grande importância dentro da indústria láctea de todo mundo, capazes de crescer em temperaturas de refrigeraçäo, independentemente da sua temperatura ótima de crescimento. A ocorrência deste grupo de microrganismos em leite cru e pasteurizado tem sido relatada e discutida por diversos autores de vários países, bem como a influência de boas práticas e sazonalidade na sua freqüência em leite refrigerado. Outro importante grupo de microrganismos é o de psicrotróficos termodúricos, que além de crescerem em refrigeraçäo, sobrevivem a altas temperaturas e promovem alteraçöes importantes no leite e seus derivados. Os microrganismos psicotróficos, termodúricos ou näo, podem produzir enzimas termorresistentes (lipases e proteases) que provocam alteraçöes no leite e principalmente nos derivados, causando assim prejuízos à indústria láctea. Esses microrganismos ganharam especial importância com a expansäo do resfriamento nas propriedades e a granelizaçäo da produçäo leiteira em diversos países do mundo, e recentemente também no Brasil.