Purification of a membrane-bound trypsin-like enzyme from the gut of the velvetbean caterpillar (Anticarsia gemmatalis Hübner) / Purificação de uma enzima "tipo tripsina" não-solúvel do intestino da lagarta da soja (Anticarsia gemmatalis Hübner)

Disruption of protein digestion in insects by specific endoprotease inhibitors is being regarded as an alternative to conventional insecticides for pest control. To optimize the effectiveness of this strategy, the understanding of the endoprotease diversity of the target insect is crucial. In this sense, a membrane-bound trypsin-like enzyme from the gut of Anticarsia gemmatalis fifth-instar larvae was purified. Non-soluble fraction of the gut extract was solubilized with 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS) and subjected to a p-aminobenzamidine affinity chromatography followed by anion-exchange chromatography. The yield of the purified enzyme was 11% with a purification factor of 143 and a final specific activity of 18.6 µM min.-1 mg-1 protein using N-α-benzoyl-L- Arg-p-nitroanilide (L-BApNA) as substrate. The purified sample showed a single band with proteolytic activity active and apparent molecular mass of 25 kDa on SDS-PAGE. Molecular mass determined by MALDI-TOF mass spectrometry was 28,632 ± 26 Da. Although the low recovery and the difficulties in purifying large enzyme amounts limited its further characterization, the results contribute for the understanding of the proteases present on A. gemmatalis gut, which are potential targets for natural or specifically designed protease inhibitors.

Comprometer a digestão de proteínas dos insetos pelo uso de inibidores específicos de endoproteases tem sido amplamente estudado como um método de controle de pragas alternativo ao uso dos inseticidas convencionais. No processo de otimização desta estratégia, o conhecimento da diversidade das endoproteases do inseto alvo torna-se crucial. Neste sentido, uma enzima "tipo-tripsina" ligada à membrana obtida do intestino de larvas do 5° instar de A. gemmatalis foi purificada. A fração insolúvel do extrato do intestino foi solubilizada com 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS) e submetida à uma cromatografia de afinidade em uma coluna de p-aminobenzamidina, seguida por uma cromatografia de troca-aniônica. O rendimento da enzima purificada foi de 11% com fator de purificação de 143 e uma atividade específica final de 18.6 µM min.-1 mg-1 de proteína usando N-α-benzoyl-L- Arg-p-nitroanilide (L-BApNA) como substrato. Após a separação da amostra purificada por SDS-PAGE e incubação subsequente com caseína, uma única banda ativa com massa molecular aparente de 25 kDa foi observada. A massa molecular determinada por espectrometria de massa (MALDI-TOF) foi de 28,632 ± 26 Da. O baixo rendimento e as dificuldades em purificar grandes quantidades da enzima limitaram caracterização complementar. A observação desta enzima, no entanto, é mais uma etapa no processo de conhecer as endoproteases presentes no intestino de A. gemmatalis, alvos potenciais de inibidores de proteases naturais ou especificamente projetados.

Improved purification process of β- and α-trypsin isoforms by ion-exchange chromatography

The purpose of this work was to improve the separation and yield of pure β- and α-trypsin isoforms by ion-exchange chromatography and to characterize some physical-chemical properties of these isoforms. Purification of trypsin isoforms was performed by ion-exchange chromatography in 0.1 mol/L tris-HC buffer, pH 7.10 at 4ºC. The sample loading, salt concentration, flow rate and pH of mobile phase were varied to determine their effects on the resolution of the separation. The resolution was optimized mainly between β- and α-trypsin. Pure isoforms were obtained by chromatographying 100 mg of commercial trypsin during seven days, yielding 51 mg of high purity β-trypsin and 13 mg of α-trypsin partially pure, with small amounts of contaminating of ψ-trypsin. Thus, time and resolution of purification were optimized yielding large amounts of pure active enzymes that are useful for several research areas and biotechnology.

O propósito deste trabalho foi melhorar a separação e o rendimento das isoformas puras β- e α-tripsina por meio de cromatografia de troca iônica e caracterizar algumas propriedades físico-químicas dessas isoformas. A purificação de isoformas de tripsina foi realizada em SE Sephadex, com tampão tris-HCl, pH 7,10 a 4ºC. A quantidade de amostra, a concentração salina, o fluxo e o pH da fase móvel foram variados para determinar o efeito sobre a resolução da separação. A resolução foi otimizada principalmente entre β- e α-tripsina, utilizando o pH 7,10 a 4ºC. Isoformas puras foram obtidas a partir de 100 mg de tripsina comercial bovina depois de sete dias de cromatografia, fornecendo 51,0 mg de β-tripsina totalmente pura e 13,0 mg de α-tripsina parcialmente pura, com quantidades pequenas de contaminação por ψ-Tripsina. Assim, tempo e resolução da purificação foram otimizados redendo grandes quantidades de enzimas puras e ativas que são úteis em várias áreas de pesquisa e ciências biotecnológicas.

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