Evaluación de tres PCR cuantitativas para la detección de leptospiras patógenas en animales domésticos en Nicaragua / Evaluation of three qPCR for the detection of pathogenic leptospires in domestic animals in Nicaragua

Resumen: Introducción. En Nicaragua es necesario estandarizar pruebas moleculares como la PCR en tiempo real (quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR) que mejoren el diagnóstico de leptospirosis en humanos y animales. Objetivo. Evaluar tres qPCR para la detección de leptospiras patógenas en animales domésticos de Nicaragua. Materiales y métodos. Se diseñaron cebadores para la amplificación del gen LipL32 en SYBR Green (SYBR Green-A) y TaqMan, y en otros descritos previamente (SYBR Green-B). Las secuencias de 12 cepas obtenidas de la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) se alinearon para la búsqueda de sondas y cebadores. La sensibilidad analítica se determinó calculando el equivalente genómico detectable, se utilizaron 18 cepas de referencia para la sensibilidad diagnóstica y 28 controles negativos para la especificidad. Los métodos se aplicaron en 129 muestras de orina de animales domésticos. Resultados. En SYBR Green-A se obtuvo un límite de detección de cuatro equivalentes genómicos; en TaqMan, la sensibilidad fue del 94,4 % (IC95% 81,1-100,0). Con SYBR Green-A, se obtuvo una sensibilidad del 77,8 % (IC95% 55,8-99,8), en tanto que con SYBR Green-B fue del 61,1 % (IC95% 35,8-86,4). En las tres pruebas se logró una especificidad del 100 % (IC95% 98,2-100,0). El 26,4 % de las muestras de animales domésticos fueron positivas con SYBR Green-A y el 6,2 % con SYBR Green-B. Conclusiones. El SYBR Green-A presentó un límite de detección bajo, en tanto que las tres técnicas evaluadas mostraron alta especificidad, en tanto que la TaqMan tuvo la mayor sensibilidad.

Abstract: Introduction: Molecular biology diagnostic methods such as real-time PCR should be used in Nicaragua to improve the diagnosis of leptospirosis in humans and animals. Objective: To evaluate three qPCR methods for pathogenic Leptospira detection in domestic animals. Materials and methods: Real-time PCR primers were designed for the amplification of specific regions from the Lip 32 gene of Leptospira in SYBER Green (SYBER Green-A) and TaqMan, as well in SYBER Green-B as previously published. The sequences of 12 strains obtained from the database of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) were aligned to select probes and primers. The analytical sensitivity was determined by calculating the detectable genomic equivalent while 18 pathogenic references strains and 28 negative controls were used to evaluate the sensitivity and specificity of each one of the three sets in 129 urine samples of domestic animals. Results: The detection limit of four genomic equivalents per reaction was obtained from SYBR Green-A. The specificities were 94.4% (95% CI: 81.1-100.0) for TaqMan, 77.8% (95% CI: 55.8-99.8) for SYBR Green-A, while for SYBR Green-B it was 61.1% (95% CI: 35.886.4). In the three tests, we obtained a specificity of 100% (95% CI: 98.2-100.0). In the field samples, 26.4% were positive with SYBR Green-A and 6.1% with SYBR Green-B. Conclusion: SYBR Green-A presented the lowest detection limit while the three techniques under evaluation showed high specificity while TaqMan was the most sensitive.

Identificación de parvovirus canino tipo 2C en cachorros de Nicaragua / Identification of canine parvovirus type 2C in puppies of Nicaragua

RESUMEN Objetivo. Identificar los genotipos de parvovirus canino-circulantes en cachorros en dos municipios de Nicaragua. Materiales y métodos. Se recolectaron muestras por hisopado rectal de 45 cachorros con y sin antecedentes de vacunación, menores de 6 meses de edad, con y sin sintomatología compatible con parvovirosis. Las muestras y dos de las vacunas que se comercializan en Nicaragua (vacuna nº1 y vacuna nº2) fueron analizadas por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) convencional para un producto de ≈630 pb del gen VP2. Además, el producto directo del PCR se secuenciaron en sentido reverso cuatro muestras de campo elegidas aleatoriamente y las dos cepas vacunales. Resultados. El 28.9% (13/45) de las muestras analizadas fueron positivas en PCR. No se encontraron diferencias significativas en la detección por PCR del fragmento de VP2, respecto al estado de vacunación de los animales (p≥0.05). Las cuatro muestras de campo secuenciadas fueron identificadas como genotipo CPV-2C y las dos cepas vacunales se identificaron como genotipo CPV- 2A. Conclusiones. la inferencia evolutiva de las secuencias alineadas de cepas vacunales mostró alta divergencia evolutiva respecto a las cepas de campo, este hallazgo lleva a replantear el tema sobre la eficacia de las vacunas analizadas en este trabajo y que son aplicadas en Nicaragua.

ABSTRACT Objective. To identify genotypes of canine parvovirus circulating in puppies in two municipalities of Nicaragua. Materials and methods. Rectal swab samples were collected from 45 puppies (less than 6 months of age) with or without a vaccination history, showing or not symptomatology compatible with parvovirosis. The samples and two of the vaccines that are marketed in Nicaragua (vaccine nº1 and vaccine nº2) were analyzed by conventional Polymerase Chain Reaction (PCR) to a product of ≈630 bp of the VP2 gene. In addition, four randomly chosen field samples and both vaccine strains were sequenced in reverse sense. Results. 28.9% (13/45) of the analyzed samples were positive by PCR, for the fragment of CPV VP2 gene. No significative difference (p≥0.05) was seen in PCR detection between dogs with or without vaccination history. The four sequenced field samples were identified as CPV-2C genotype while both vaccine strains were identified as CPV-2A genotype. Conclusions. The aligned sequences showed high evolutionary divergence of filed strains with respect to vaccines strains, leading us to rethink the efficacy of the analyzed vaccines which are nowadays commercially available in Nicaragua.

Detección de Leptospira spp. en animales y muestras ambientales de áreas peridomésticas en Nicaragua / Detection of Leptospire spp. in animals and in environmental samples from peridomestic areas in Nicaragua / Detecção de Leptospira spp. em animais e em amostras ambientais de áreas peridomiciliares na Nicarágua

RESUMEN Objetivo El objetivo de este estudio fue conocer las características epidemiológicas de la leptospirosis en animales domésticos y en los casos de leptospirosis humana en áreas peridomésticas en Nicaragua entre 2014 y 2016. Métodos Las muestras se extrajeron en áreas donde se confirmaron casos en humanos utilizando un muestreo no probabilístico en 10 de los 17 departamentos del país. Se incluyeron 112 muestras de orina de animales domésticos, 129 muestras de agua y 69 de tierra para aislar leptospiras en medio Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH). Además, se aplicó la prueba de microaglutinación (MAT) en 263 muestras de suero de animales y 88 aislados se analizaron mediante PCR. Resultados En 32,6% (101/310) de las muestras se aislaron espiroquetas, 23,2% (26/112) se aislaron en la orina de animales domésticos, 47,3% (61/129), en las muestras de agua y 20,3 % (14/69), en las de tierra. El análisis de aislamiento mostró diferencias significativas (P < 0,05) entre los departamentos para los diferentes tipos de muestras, y el aislamiento fue más frecuente en agua que en tierra (OR = 3,49; IC95%: 1,56-7,80). El 14,1% (37/263) de los animales fueron reactores en la prueba de microaglutinación. El serogrupo más frecuente fue Icterohaemorrhagiae (40%). En el análisis con la PCR para identificar leptospiras de las especies patógenas 10,2% (9/88) de los aislamientos fueron positivos. Conclusiones Esta investigación demuestra que los animales domésticos y el ambiente desempeñan un papel importante en la aparición de brotes de la leptospirosis y confirma el comportamiento endémico de la enfermedad en Nicaragua.

ABSTRACT Objective The objective of this study was to determine the epidemiological characteristics of leptospirosis in pets and in humans in peridomestic settings in Nicaragua between 2014 and 2016. Methods The samples were taken in areas where cases were confirmed in humans using non-probabilistic sampling in 10 of the country's 17 departments. This included 112 urine samples from pets, 129 water samples, and 69 soil samples in order to isolate leptospires in Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH) medium. Furthermore, the microscopic agglutination test (MAT) was applied to 263 samples of animal serum, and 88 isolates were analyzed using PCR. Results In 32.6% (101/310) of the samples, spirochetes were isolated: 23.2% (26/112) in the pet urine, 47.3% (61/129) in water samples, and 20.3% (14/69) in soil samples. Isolation analysis showed significant differences (p<0.05) between departments for the different types of samples, and isolation was more frequent in water than in soil (OR = 3.49; CI95%: 1.56-7.80). In total, 14.1% (37/263) of the animals were reactors in the microscopic agglutination test. The most frequent serogroup was Icterohaemorrhagiae (40%). PCR analysis to identify pathogenic species of leptospires resulted in 10.2% (9/88) positive isolations. Conclusions This research demonstrates that pets and environment conditions play an important role in the emergence of outbreaks of leptospirosis, and confirms the endemic behavior of the disease in Nicaragua.

RESUMO Objetivo Descrever as características epidemiológicas da leptospirose em animais domésticos e em casos de leptospirose humana em áreas peridomiciliares na Nicarágua entre 2014 e 2016. Métodos As amostras foram coletadas por amostragem não probabilística em áreas com casos confirmados de leptospirose humana em 10 das 17 províncias do país. Foram analisadas 112 amostras de urina de animais domésticos, 129 amostras de água e 69 amostras de solo com o uso do meio de cultura padrão para o isolamento de leptospiras (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris, EMJH). Além disso, foi realizado o teste de aglutinação microscópica em 263 amostras séricas de animais e 88 isolados foram analisados com a técnica de PCR. Resultados Em 32,6% (101/310) das amostras foram isoladas espiroquetas, sendo 23,2% (26/112) isoladas na urina de animais domésticos, 47,3% (61/129) nas amostras de água e 20,3% (14/69) nas amostras de solo. Houve diferença significativa (P < 0,05) entre as províncias no isolamento nos diferentes tipos de amostras analisadas, sendo o isolamento mais frequente nas amostras de água que de solo (OR = 3,49; IC95%: 1,56-7,80). Reatividade no teste de aglutinação microscópica foi observada em 14,1% (37/263) das amostras de animais. O sorogrupo mais frequentemente isolado foi Icterohaemorrhagiae (40%). A técnica de PCR demonstrou que 10,2% (9/88) dos isolados eram positivos para espécies patogênicas de leptospiras. Conclusões Esta pesquisa demonstra que os animais domésticos e o entorno têm papel importante no surgimento de surtos de leptospirose e confirma o comportamento endêmico da doença na Nicarágua.