Caracterização clínica, molecular e genética de pacientes com câncer colorretal abaixo de 50 anos / Clinical, molecular and genetic characterization of colorectal cancer patients under 50 years of age

Introdução: Pacientes com câncer colorretal (CCR) em idade jovem (< 50 anos) apresentam maior risco de apresentar variantes germinativas em genes de predisposição ao câncer, entre eles os genes da Síndrome de Lynch (SL) (genes MMR - MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2). Detectar a perda de expressão de proteínas de reparo de incompatibilidade de DNA (MMR) é altamente relevante para identificar pacientes com síndrome de Lynch. No entanto, a inativação de MLH1 devido à hipermetilação do promotor ocorre em 15% dos cânceres colorretais (CCRs) esporádicos e está correlacionada com mutações somáticas BRAF. Ainda, apesar das principais síndromes hereditárias de CCR representarem 15-19% dos casos de CCR de início precoce, a etiologia da maior parte dos CCRs nestes pacientes é desconhecida, mesmo com até 25% destes casos apresentando história familiar importante para essa neoplasia. Objetivo: Caracterizar o fenótipo clínico e molecular (somático e germinativo) de pacientes com CCR desenvolvido antes dos 50 anos tratados no A.C.Camargo Cancer Center. Materiais e Métodos: Pacientes com câncer colorretal <50 anos foram selecionados a partir do banco de dados do Departamento de Cirurgia Pélvica ou pelo encaminhamento do Departamento de Oncogenética. A análise de metilação do promotor de MLH1 foi realizada por sequenciamento de nova geração (NGS) a partir de DNA convertido por bissulfito de sódio, em uma metodologia desenvolvida e validada nesse estudo. A análise de mutação de BRAF foi realizada por NGS de amplicon. Para um subgrupo de pacientes com critérios clínicos e moleculares específicos (tumores MMR deficientes, história familiar positiva para CCR, mutação KRAS: G12C e/ou idade <40 anos) foi realizado o sequenciamento germinativo de genes de predisposição ao CCR. Na avaliação das variantes germinativas foi utilizado um painel multigênico com 62 genes de associação conhecida, emergente ou desconhecida para predisposição ao CCR. As variantes identificadas foram classificadas segundo os critérios sugeridos pelo American College of Medical Genetics (ACMG). Resultados: Para análise de metilação de MLH1 utilizamos DNA de tumores FFPE e saliva foi tratado com bissulfito, amplificado por PCR e avaliado por NGS. Em tumores deficientes em MLH1/PMS2, o estado de metilação de MLH1 foi concordante com o estado de mutação BRAF em 90% (18/20) dos casos. Nosso teste NGS baseado em amplicon mostrou uma grande sensibilidade e especificidade para detectar a metilação de MLH1 em amostras de CCR, com alta concordância com a avaliação da mutação BRAF. A avaliação das variantes germinativas foi realizada em 89 pacientes, e identificamos 24 (27%) pacientes com variantes patogênicas ou provavelmente patogênicas (P/PP). A maioria dos pacientes 53% (47/89) apresentaram variantes de significado incerto (VUS) e 18 (20%) pacientes apresentaram apenas variantes sem significado clínico para os 62 genes avaliados. Dos 24 pacientes com variantes patogênicas, 16 (66,6%) apresentaram variantes P/PP em genes da síndrome de Lynch. Cinco pacientes (20%) apresentaram variantes P/PP em MUTYH (3 bialélicos e 2 monoalélicos). Dois (8,3%) pacientes tinham variantes PP em FAN1. Um paciente apresentou uma variante PP em NTHL1 (monoalélica), e para os genes XRCC4 e RAD51C tivemos um paciente cada com alteração. Dois pacientes apresentaram variantes P/PP em mais de 1 gene (1 MLH1 com FAN1, 1 MUTYH com XRCC4). Conclusão: Em nosso trabalho fomos capazes de desenvolver com sucesso uma metodologia baseada em NGS para avaliação de metilação no promotor do gene MLH1, para caracterizar molecularmente as amostras tumorais do grupo de pacientes com deficiência nos genes de reparo relacionados a causas esporádicas (metilação de MLH1 e mutação de BRAF). Além disso, identificamos variantes germinativas com evidência definitiva de predisposição ao CCR em 1 a cada 4 pacientes da nossa coorte, além de termos identificado variantes patogênicas em genes com evidência limitada ou ausente de predisposição hereditária ao câncer CCR, como é o caso dos genes RAD51C, XRCC4 e FAN1.

Introduction: Patients with colorectal cancer (CRC) at a young age (< 50 years) are at greater risk of having germline variants in cancer predisposition genes, including Lynch Syndrome (LS) genes (MMR genes - MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2). Detecting the loss of expression of DNA mismatch repair (MMR) proteins is highly relevant to identify patients with Lynch syndrome. However, inactivation of MLH1 due to promoter hypermethylation occurs in 15% of sporadic colorectal cancers (CRCs) and is correlated with somatic BRAF mutations. Also, although the main hereditary syndromes of CRC represent 15-19% of cases of early-onset CRC, the etiology of most CRCs in these patients is unknown, even with up to 25% of these cases presenting an important family history of this neoplasm. Objective: To characterize the clinical and molecular phenotype (somatic and germline) of patients with CRC developed before the age of 50 years treated at the A.C.Camargo Cancer Center. Materials and Methods: Colorectal cancer patients <50 years were selected from the database of the Department of Pelvic Surgery or by referral from the Department of Oncogenetics. MLH1 promoter methylation analysis was performed by next-generation sequencing (NGS) from DNA converted by sodium bisulfite, in a methodology developed and validated in this study. BRAF mutation analysis was performed by amplicon NGS. For a subgroup of patients with specific clinical and molecular criteria (MMR deficient tumors, positive family history for CCR, KRAS:G12C mutation, and/or age <40 years) germline sequencing of CRC predisposing genes was performed. In the evaluation of germline variants, a multigene panel with 62 genes of known, emerging or unknown association for CRC predisposition was used. The identified variants were classified according to the criteria suggested by the American College of Medical Genetics (ACMG). Results: For MLH1 methylation analysis we used DNA from FFPE tumors and saliva was treated with bisulfite, amplified by PCR and evaluated by NGS. In MLH1/PMS2 deficient tumors, MLH1 methylation status was concordant with BRAF mutation status in 90% (18/20) of cases. Our amplicon-based NGS test showed great sensitivity and specificity for detecting MLH1 methylation in CRC samples, with high agreement with the BRAF mutation assessment. The evaluation of germline variants was performed in 89 patients, and we identified 24 (27%) patients with pathogenic or probably pathogenic (P/PP) variants. Most patients 53% (47/89) had variants of uncertain significance (VUS) and 18 (20%) patients had only variants without clinical significance for the 62 genes evaluated. Of the 24 patients with pathogenic variants, 16 (66.6%) had P/PP variants in Lynch syndrome genes. Five patients (20%) had P/PP variants in MUTYH (3 biallelic and 2 monoallelic). Two (8.3%) patients had PP variants in FAN1. One patient had a PP variant in NTHL1 (monoallelic), and for the XRCC4 and RAD51C genes we had one patient each with alteration. Two patients had P/PP variants in more than 1 gene (1 MLH1 with FAN1, 1 MUTYH with XRCC4). Conclusion: In our work, we were able to successfully develop a methodology based on NGS for the evaluation of methylation in the promoter of the MLH1 gene, to molecularly characterize the tumor samples from the group of patients with deficiency in the repair genes related to sporadic causes (MLH1 methylation and BRAF mutation). In addition, we identified germline variants with definitive evidence of predisposition to CRC in 1 out of 4 patients in our cohort, in addition to having identified pathogenic variants in genes with limited or no evidence of hereditary predisposition to CRC cancer, such as the RAD51C genes, XRCC4 and FAN1.

Toxicity in food flavorings at the cellular level associated with each other at different doses / Toxicidade em nível celular de aromatizantes alimentares associados entre si em diferentes doses

This study aimed to examine the cytotoxicity and genotoxicity of synthetic flavorings, nature identical, Chocolate, Strawberry and Condensed Milk. This evaluation was performed in root meristem cells of Allium cepa L., in exposure times of 24 and 48 hours and using doses of 0.2; 0.4 and 0.6 mL, in combination, in which one of the three doses of a flavoring was combined with a different dose of one of the two other flavor additives studied. Roots were fixed in Carnoys solution, hydrolyzed in hydrochloric acid, stained with acetic orcein and then analyzed, under light microscopy, 5,000 cells for each treatment. For data analysis, it was used Chi-square test at 5%. All the treatments with combinations between the flavorings Chocolate/Strawberry and Strawberry/Condensed Milk reduced, in both exposure times considered, cell division of A. cepa roots, proving to be cytotoxic. In turn, the treatments with the association of Chocolate/Condensed Milk did not change significantly the mitotic index of the cells analyzed. The Strawberry flavoring was the most cytotoxic among the additives tested. None of the evaluated associations was genotoxic under the study conditions.

Objetivou-se nesta pesquisa avaliar a citoxicidade e genotoxicidade de aromatizantes alimentares sintéticos de chocolate, morango e leite condensado. Esta avaliação ocorreu por meio das células meristemáticas de raízes de A. cepa L., nos tempos de exposição de 24 e 48h e nas doses de 0,2; 0,4 e 0,6 mL, em associação, em que para uma das três doses de um dos aromatizantes associou-se uma dose diferente de um dos outros dois aditivos de aroma em estudo. Em seguida, as raízes foram fixadas em solução de Carnoy, hidrolisadas em ácido clorídrico e coradas com orceína acética. Analisaram-se, em microscópio óptico, 5.000 células para cada grupo tratamento, e utilizou-se o teste estatístico Qui-quadrado a 5% para análise dos dados. A partir dos resultados, verificou-se que todos os tratamentos decorrentes das associações entre chocolate/morango e morango/leite condensado reduziram, nos dois tempos de exposição considerados, a divisão celular das raízes A. cepa, mostrando-se citotóxicos. Já os tratamentos provenientes da associação chocolate/leite condensado não alteraram de forma significativa os índices mitóticos das células do tecido em análise. Foi possível inferir que o aditivo de morango foi o mais citotóxico dos aditivos em estudo. Nenhuma das associações avaliadas foi genotóxica nestas condições de estudo.

Toxicity in food flavorings at the cellular level associated with each other at different doses / Toxicidade em nível celular de aromatizantes alimentares associados entre si em diferentes doses

This study aimed to examine the cytotoxicity and genotoxicity of synthetic flavorings, nature identical, Chocolate, Strawberry and Condensed Milk. This evaluation was performed in root meristem cells of Allium cepa L., in exposure times of 24 and 48 hours and using doses of 0.2; 0.4 and 0.6 mL, in combination, in which one of the three doses of a flavoring was combined with a different dose of one of the two other flavor additives studied. Roots were fixed in Carnoy's solution, hydrolyzed in hydrochloric acid, stained with acetic orcein and then analyzed, under light microscopy, 5,000 cells for each treatment. For data analysis, it was used Chi-square test at 5%. All the treatments with combinations between the flavorings Chocolate/Strawberry and Strawberry/Condensed Milk reduced, in both exposure times considered, cell division of A. cepa roots, proving to be cytotoxic. In turn, the treatments with the association of Chocolate/Condensed Milk did not change significantly the mitotic index of the cells analyzed. The Strawberry flavoring was the most cytotoxic among the additives tested. None of the evaluated associations was genotoxic under the study conditions.

Objetivou-se nesta pesquisa avaliar a citoxicidade e genotoxicidade de aromatizantes alimentares sintéticos de chocolate, morango e leite condensado. Esta avaliação ocorreu por meio das células meristemáticas de raízes de A. cepa L., nos tempos de exposição de 24 e 48h e nas doses de 0,2; 0,4 e 0,6 mL, em associação, em que para uma das três doses de um dos aromatizantes associou-se uma dose diferente de um dos outros dois aditivos de aroma em estudo. Em seguida, as raízes foram fixadas em solução de Carnoy, hidrolisadas em ácido clorídrico e coradas com orceína acética. Analisaram-se, em microscópio óptico, 5.000 células para cada grupo tratamento, e utilizou-se o teste estatístico Qui-quadrado a 5% para análise dos dados. A partir dos resultados, verificou-se que todos os tratamentos decorrentes das associações entre chocolate/morango e morango/leite condensado reduziram, nos dois tempos de exposição considerados, a divisão celular das raízes A. cepa, mostrando-se citotóxicos. Já os tratamentos provenientes da associação chocolate/leite condensado não alteraram de forma significativa os índices mitóticos das células do tecido em análise. Foi possível inferir que o aditivo de morango foi o mais citotóxico dos aditivos em estudo. Nenhuma das associações avaliadas foi genotóxica nestas condições de estudo.