Neutrophils, eosinophils, and mast cells in the intestinal wall of dogs naturally infected with Leishmania infantum / Neutrófilos, eosinófilos e mastócitos na parede intestinal de cães naturalmente infectados com Leishmania infantum

Abstract Visceral leishmaniasis (VL) is a disease caused by the protozoa Leishmania infantum and can cause an inflammatory reaction in the gastrointestinal tract, however the role of granulocytic cells (neutrophils, eosinophils, and mast cells) in the intestine of dogs infected is not fully understood. We performed a quantitative analysis these cells in the intestinal wall of dogs with canine visceral leishmaniasis (CVL). Twenty dogs were assigned to one of three groups: group 1 (G1, n=8), dogs with CVL and L. infantum amastigotes in the intestine; group 2 (G2, n=9), dogs with CVL but without intestinal amastigotes; and group 3 (G3, n=3), uninfected dogs (control group). Granulocytic cells were counted in the crypt-villus unit (mucosa), submucosa, and muscle layer of the intestinal mucosa. Cell counts were higher in the intestinal wall of dogs from G2 followed by G1 and G3 (p≤0.05). In G1, there was a low inverse correlation between parasite burden of the small intestine and granulocyte counts (r= -0.1, p≤0.01). However, in G2 dogs, mast cell and eosinophil numbers showed positive correlation (r=0.85, p≤0.01). The granulocytic cell hyperplasia observed in the intestine of L. infantum-infected dogs suggests that these cells may be involved in the cell-mediated immune response for parasite elimination.

Resumo A leishmaniose visceral (LV) é uma doença causada pelo protozoário Leishmania infantum e pode causar uma reação inflamatória no trato gastrointestinal, entretanto o papel das células granulocíticas (neutrófilos, eosinófilos e mastócitos) no intestino de cães infectados não é totalmente compreendido. Neste estudo realizamos uma análise quantitativa dessas células na parede intestinal de cães com LV. Vinte cães foram distribuídos em três grupos: grupo 1 (G1, n=8), cães com LV e amastigotas de L. infantum no intestino; grupo 2 (G2, n=9), cães com LV, mas sem amastigotas intestinais; e grupo 3 (G3, n=3), não infectados (grupo controle). Células granulocíticas foram contadas na unidade cripta-vilo (mucosa), submucosa e camada muscular da mucosa intestinal. Observamos hiperplasia dessas células na parede intestinal de cães do G2, seguidas das G1 em relação ao G3 (p≤0,05). No G1, houve uma correlação inversa baixa entre a carga parasitária do intestino delgado e a contagem de granulócitos (r= -0,1; p≤0,01). No entanto, nos cães do G2, os números de mastócitos e eosinófilos apresentaram correlação positiva (r=0,85; p≤0,01). A hiperplasia de células granulocíticas observada no intestino de cães infectados por L. infantum sugere que essas células podem estar envolvidas na resposta imune mediada por células para a eliminação do parasita.

T lymphocytes and macrophages in the intestinal tissues of dogs infected with Leishmania infantum / Linfócitos T e macrófagos nos tecidos intestinais de cães infectados com Leishmania infantum

Abstract This study was about a semi-quantitative analysis of T lymphocytes (CD4+ and CD8+, FoxP3+ regulatory T cells), and macrophages in the gut wall of dogs naturally infected with Leishmania infantum. Thirteen dogs were divided into three groups: group 1 (G1, n=5), dogs with canine visceral leishmaniasis (CVL) and infected with L. infantum amastigotes in the intestine; group 2 (G2, n=5), dogs with CVL but without intestinal amastigotes; and group 3 (G3, n=3), uninfected dogs (control group). There was no significant difference (p ≥ 0.05) on CD4+ and Treg cell numbers among the groups, whereas the levels of CD8+ T cells and macrophages were significantly higher in dogs from G1 group than in G2 and G3 (p ≤ 0.05), especially in intestinal segments with high parasite burden. Parasite burden correlated positively with levels of CD8+ T cells and macrophages (p ≤ 0.05), but was inversely correlated to levels of CD4+ T lymphocytes and FoxP3+ Treg cells. In conclusion, in the intestine of dogs with CVL, the increase of CD8+ T cells and macrophages population associated with high parasite burdens, but no changes of CD4+ T cells and FoxP3+ Treg cells suggest a possible immunoregulation by the parasite not dependent on Treg cells.

Resumo Este estudo foi uma análise semi-quantitativa de linfócitos T (CD4+, CD8+ e regulatórios - Treg FoxP3+) e macrófagos na parede intestinal de cães naturalmente infectados com Leishmania infantum. Treze cães foram divididos em três grupos: grupo 1 (G1, n=5) continha cães com leishmaniose visceral canina (LVC) e com amastigotas intestinais; grupo 2 (G2, n=5) continha cães com LVC, mas sem amastigotas intestinais e o grupo 3 (G3, n=3) continha cães não infectados (grupo controle). Verificou-se que não houve diferença significativa (p ≤ 0.05) no número de células CD4+ e de Treg entre os grupos, mas o número de células T CD8+ e macrófagos foi significativamente superior nos cães do grupo G1 em relação ao G2 e ao G3 (p ≤ 0,05), especialmente nos segmentos intestinais com altas cargas parasitárias. As altas cargas parasitarias correlacionaram positivamente com os números de CD8+ e macrófagos (p ≤ 0,05), mas negativamente com as células CD4+ e Treg. Em conclusão, no intestino dos cães com LVC, o aumento das populações de células T CD8+ e de macrófagos associado a altas cargas parasitárias, mas nenhuma alteração de células T CD4+ e células Treg FoxP3+ sugerem uma possível imunorregulação pelo parasita não dependente de células Treg.

EVIDENCE OF Leishmania (Leishmania) infantum INFECTION IN DOGS FROM JUIZ DE FORA, MINAS GERAIS STATE, BRAZIL, BASED ON IMMUNOCHROMATOGRAPHIC DUAL-PATH PLATFORM (DPP®) AND PCR ASSAYS / Evidência de infecção por Leishmania (Leishmania) infantum em cães de Juiz de Fora, Minas Gerais, Brasil, detectada pelo teste imunocromatográfico rápido DPP e PCR

In Brazil, domestic dogs are branded as the primary reservoir for zoonotic visceral leishmaniasis, due to the clear positive correlation observed between human and canine infection rates. This study aimed to carry out a serological survey of canine visceral leishmaniasis (CVL) in dogs housed at a public kennel in the municipality of Juiz de Fora, Minas Gerais State, Brazil, using the immunochromatographic TR DPP® CVL rapid test. Additionally, conventional and/or real time PCR assay was used to detect and confirm L. infantum infection in the DPP positive dogs only. Of the 400 dogs studied, most did not present clinical signs for CVL (p < 0.05), and fifteen (3.8%) were seropositive in the DPP test. There was no statistically significant difference between the DPP seropositive dogs and the clinical signs of the disease (p > 0.05). Both conventional and real time PCR tests confirmed L. infantum infection in nine (75.0%) of the twelve DPP seropositive dogs that remained alive during the follow-up period. This study is the first seroepidemiologic survey of CVL held in the city of Juiz de Fora, and the results reinforce the idea that this disease is currently in a process of expansion and urbanization in Brazil. Furthermore, this study highlights the use of the DPP test as an alternative for diagnosing CVL in large and mid-sized cities, due to its ease of implementation.

No Brasil, cães domésticos são considerados como os principais reservatórios da leishmaniose visceral zoonótica, devido à clara correlação positiva existente entre as curvas de infecção humana e canina. Este estudo objetivou a realização de um inquérito sorológico da leishmaniose visceral canina (LVC) em cães abrigados em um canil público de Juiz de Fora, Minas Gerais, Brasil, através do teste rápido imunocromatográfico TR DPP®. Adicionalmente, a PCR convencional e/ou em tempo real foi usada para detectar/confirmar a infecção por L. infantum apenas nos animais DPP positivos. Dos 400 cães estudados, a maioria não apresentou sinais clínicos para a LVC (p < 0,05) e quinze (3,8%) foram sororreativos ao DPP. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os cães com DPP positivo e os sinais clínicos para a doença (p > 0,05). PCR convencional e em tempo real confirmaram a infecção por L. infantum em nove (75,0%) dos doze animais DPP positivos que permaneceram vivos durante o estudo. Este é o primeiro estudo soroepidemiológico sobre LVC realizado no município de Juiz de Fora, e os resultados reforçam a idéia de que esta doença está em processo de expansão e urbanização no Brasil. Além disto, este estudo destaca o uso do DPP como uma alternativa para o diagnóstico da LVC em cidades de médio e grande porte, devido à facilidade de execução.

Estudo comparativo dos métodos diagnósticos para Leishmaniose Visceral em cães oriundos de Ilha Solteira, SP / Comparative study of diagnostic methods for visceral leishmaniasis in dogs from Ilha Solteira, SP

O objetivo da presente pesquisa foi avaliar comparativamente os métodos diagnósticos da Leishmaniose Visceral Canina (LVC), utilizando-se o ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), a reação de imunofluorescência indireta (RIFI), a histoquímica (HE) e a imunoistoquímica (IMIQ) em tecidos de órgãos, como o baço, linfonodo e fígado. Além disso, a Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) das amostras de sangue e dos tecidos foi utilizada para comparar e confirmar os diagnósticos negativos e não conclusivos pelos métodos acima. Para esse estudo, foram utilizados 34 cães com diferentes sintomas da LVC, classificados em polissintomáticos, oligossintomáticos e assintomáticos e eutanasiados no Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) de Ilha Solteira, SP. Os índices de positividade para os testes ELISA, IMIQ, RIFI e HE foram de 65,0, 62,0, 56,0 e 56,0 por cento, respectivamente, sendo a maior positividade detectada nos cães polissintomáticos (92,0 por cento), seguida pelos oligossintomáticos (57,0 por cento) e assintomáticos (12,5 por cento). A PCR confirmou os resultados positivos pelas outras técnicas e ainda detectou DNA do parasita nos tecidos de 100 por cento dos cães negativos e em 89,0 por cento dos suspeitos, elevando para 97,0 por cento a positividade. Em conclusão, a PCR demonstrou ser o método mais sensível e preciso para o diagnóstico definitivo da LVC.

The purpose of the present work was a comparative study of diagnostic methods for Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) using serological methods, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and indirect fluorescent antibody test (IFAT), histochemical (HE) and immunohistochemical (IMHC) tests using spleen, lymph node and liver canine tissues. In addition, Polymerase Chain Reaction (PCR) was done in blood and in tissues in order to compare and confirm no conclusive and negative diagnosis by the methods above. For this study, 34 dogs were divided according to clinical signs in asymptomatic, oligosymptomatic and polisymptomatic Leishmania-infected dogs euthanized by Zoonotic Disease Control Center (CCZ) from Ilha Solteira, SP, Brazil. The positivism indexes of ELISA, IMHC, IFAT and HE were 65.0, 62.0, 56.0 and 56.0 percent, respectively with the highest numbers of positive dogs in polisymptomatic (92.0 percent) followed by oligosymptomatic (57.0 percent) and asymptomatic dogs (12.5 percent). Furthermore, PCR confirmed the positive results and detected DNA in tissues from 100 percent of negative dogs and 89.0 percent suspects raising the animal positivism index up to 97.0 percent. In conclusion, PCR was the most sensitive and a valuable method for a definitive CVL diagnosis.