RESUMO
O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, transmitida através de insetos vetores triatomíneos durante a alimentação do hospedeiro vertebrado. Os triatomíneos ingerem numa única alimentação cerca de 10 mM de heme ligado à hemoglogina. O heme é uma importante molécula no metabolismo dos organismos. Um mecanismo intracelular importante no controle de sua homeostase é a degradação enzimática pela Heme Oxigenase (HO) formando biliverdina (Bv), monóxido de carbono e ferro. Como esta enzima não está presente no genoma de T. cruzi, esse trabalho tem por objetivo identificar uma atividade funcional de HO neste parasito, uma vez que dados do nosso laboratório mostram a presença de biliverdina nas incubações dessas células com heme. No presente trabalho testamos o efeito do SnPPIX (inibidor da HO-1), CoPPIX (indutor da HO-1) e Bv sobre a proliferação da forma epimastigota do parasito. A adição de SnPPIX diminuiu a proliferação do parasito tanto na ausência quanto na presença de heme. Quando a Bv foi adicionada à cultura esse efeito foi revertido; a Bv aumenta a proliferação celular na presença de heme. Por outro lado, a adição de CoPPIX não interferiu na proliferação. Posteriormente, mostramos através da técnica de immunoblotting, utilizando anticorpo monoclonal contra a HO-1, um aumento da expressão de uma proteína em resposta ao heme. Diferentemente das HO-1 já descritas que possuem massa molecular de 32 kDa, a única banda reconhecida pelo anticorpo apresenta 45 kDa. Analisamos também a expressão da HO-1 na presença de CoPPIX, SnPPIX e biliverdina, e somente o CoPPIX foi capaz de modular os níveis de expressão da HO-1. A análise estrutural através da técnica de imunocitoquímica mostrou uma maior expressão da enzima na presença de heme, e que a HO-1 de T. cruzi pode ter mais de uma localização, apresentando marcação citoplasmática e glicossomal. A fim de investigar a sequência da HO-1 de T. cruzi, o DNA genômico foi extraído para amplificação ...
Trypanosoma cruzi, the ethiologic agent of Chagas disease, is transmitted through triatomine vectors during their blood-meal on vertebrate host. These hematophagous insects ingest blood about 6 to 12 times its original weight, reaching in a single meal about 10mM heme bound to hemoglobin. Heme (iron protoporphyrin IX) is an important molecule in metabolism of all living organisms. One important intracellular mechanism to control heme homeostasis is its enzymatic degradation by heme oxygenase (HO). HO catalyzes the degradation of heme to biliverdin (Bv), carbon monoxide and iron. HO is absent in T. cruzi genome, thus we have been investigating the presence of a functional HO in this parasite, since our previous results showed a presence of biliverdin in heme-treated epimastigotes. In the present work, we evaluated the effect of SnPPIX, a HO-1 inhibitor, CoPPIX, a HO inducer, and Bv upon T. cruzi epimastigotes proliferation. The addition of SnPPIX decreased the parasite proliferation in the absence or in the presence of heme. When Bv was added to the culture this effect was reversed; Bv increases the parasite proliferation in the presence of heme. On the other hand, CoPPIX did not interfered on proliferation. Furthermore, we showed through immunoblotting, using an anti-HO-1 monoclonal antibody, an increase in the protein expression in heme-treated epimastigotes. Differently of described HO-1 that has a mass molecular of a 32 kDa, we showed a 45 kDa protein, the only band recognize by the HO-1 antibody. HO-1 expression analysis in the presence of CoPPIX, SnPPIX and biliverdin, showed that only CoPPIX was able to modulate its expression level. Ultrastructural immunocytochemistry analysis suggests a higher expression of the enzyme in heme-treated epimastigotes, and that T. cruzi HO-1 might have a dual distribution, since the anti-HO-1 antibody labeled both cytosol and glycosomes. In order to investigate the T. cruzi HO-1 gene sequence, we isolated genomic DNA ...
Assuntos
Heme Oxigenase-1/análise , Heme Oxigenase-1/antagonistas & inibidores , Heme/metabolismo , Trypanosoma cruzi/enzimologia , Trypanosoma cruzi/genética , Biliverdina , DNA , Eletroforese em Gel de Poliacrilamida , Análise Espectral/métodos , Immunoblotting/métodos , Reação em Cadeia da PolimeraseRESUMO
O Trypanossoma cruzi é o agente etiológico da Doença de Chagas, que é transmitida através de insetos vetores triatomíneos durante a alimentação no hospedeiro vertebrado. A doença de Chagas é um grave problema na América Latina, e apesar disso a quimioterapia existente para a doença ainda não é satisfatória, sendo pouco eficaz em seus estágios avançados, além de ser extremamente tóxica para o hospedeiro. Os triatomíneos chegam a ingerir em sangue, de 6 a 12 vezes o seu peso original, ingerindo numa única alimentação cerca de 10 mM de heme ligado à hemoglobina. Como a forma epimastigota de T. cruzi vive em constante presença de heme, começamos a investigar sua participação na proliferação do parasito como molécula sinalizadora. No presente trabalho testamos diversos inibidores de proteínas quinases in vitro. Somente o KN93 (2M), inibidor de quinases dependentes de Ca2+/CaM (multifuncionais), teve um efeito inibitório da ação do heme, enquanto os demais inibidores não alteraram a proliferação destas células. Quando utilizado o KN92, um análogo sem atividade inibitória, este não apresentou efeito, mostrando então a especificidade do KN93. A fim de identificar qual CaMK está envolvida na proliferação mediada por heme, testamos o peptídeo Myr-AIP, um inibidor altamente específico e potente, derivado do substrato da CaMKII, e observamos que a adição do inibidor na cultura bloqueou a proliferação dos parasitos na presença de heme, confirmando o efeito específico sobre a proliferação mediada por heme, e o envolvimento da via da CaMKII. Através da técnica de western blotting mostramos o aumento da fosforilação da CaMKII na presença de heme, confirmando o envolvimento da CaMKII nesse processo. Posteriormente, ensaiamos a atividade da CaMKII utilizando uma CaMKII recombinante comercial. Vimos que a adição de heme 300 ?M no meio de reação aumentou a atividade enzimática cerca de 10 vezes, corroborando o resultado obtido no western blotting, e sugerindo a existência de dif...