Investigação genética dos abortamentos espontâneos pelo DNA / Genetic investigation of spontaneous abortions by DNA techniques

Os abortamentos espontâneos são fenômenos comuns, mas emocionalmente devastadores. Uma explicação científica da causa da perda fatal é fundamental para o casal poder restaurar a sua homeostase emocional e para o médico orientar a sua conduta. Mais de 50% dos abortamentos apresentam anormalidades cromossômicas, especialmente trissomias (60%), triploidia (15%) e monossomia X (15%). Assim, o cariótipo fetal deve ser feito, se possível, em todos os casos de perda gestacional. Os estudos cromossômicos convencionais dependem da cultura de células fetais estar associada com falhas de crescimento in vitro e contaminação com células maternas. Uma alternativa vantajosa é a citogenética molecular, que estuda o cariótipo fatal diretamente ao nível do DNA, dispensando a cultura de tecidos e permitindo até a análise de espécimes fixados em formol, etanol ou incluídos em parafina. Este artigo descreve a implantação no GENE - Núcleo de Genética Médica - de uma metodologia própria de estudos genéticos de abortamentos usando a reação em cadeia da polimerase (PCR) e permitindo o diagnóstico das principais trissomias, da triploidia e da monossomia X. Neste trabalho fazemos uma revisão da análise de 1.096 abortamentos estudados por três protocolos diferentes: citogenética convencional (Protocolo 1), citogenética convencional + citogenética molecular (Protocolo 2), ou citogenética molecular isoladamente (Protocolo 3). O nosso objetivo foi comparar resultados obtidos após a implantação dos estudos moleculares com os resultados anteriores. A conclusão do estudo foi que o procedimento de citogenética molecular implantado é simples, eficiente e de baixo custo e representa uma ferramenta de grande utilidade clínica.

Spontaneous abortions are common, but emotionally devastating events. A scientific explanation of the cause of the fetal death is important for the parents to restore their emotional homeostasis and for the physicians involved plan their conduct. More than 50% of miscarriages have chromosomal abnormalities, especially trisomies (60%), triploidy (15%) and monosomy X (15%). Thus, a fetal karyotype should be obtained in all abortions, if possible. Conventional chromosome studies depend on fetal cell cultures and are thus associated with growth failures in vitro and contamination with maternal cells. An advantageous alternative to conventional methods is molecular cytogenetics, which is based on studying the fetal karyotype directly at the DNA level. This has the advantage of dispensing with tissue culture and allows analysis even of specimens fixed in ethanol or formaldehyde or included in paraffin. We wish to describe the development at GENE — Núcleo de Genética Médica — of a methodology for the molecular cytogenetic study of miscarriages using the polymerase chain reaction (PCR), permitting the diagnosis of the most common trisomies, of triploidy and of monosomy X. In this article we review the results of 1,096 abortion specimens studies by one of three protocols: conventional cytogenetics (Protocol 1), conventional cytogenetics + molecular cytogenetics (Protocol 2) and molecular cytogenetics alone (Protocol 3). Our objective was to compare data obtained with molecular cytogenetics with previous results. The conclusion was that the protocols developed with the use of molecular techniques are simple, efficient and inexpensive and represent a tool of great clinical usefulness.

Screening fetal losses for monosomy X with a simple PCR-based procedure

Para a detecçäo molecular de monossomia X em perdas fetais espontâneas, nós exploramos uma estratégia baseada em perda e heterozigosidade, desenvolvendo um sistema multiplex fluorescente que permite a amplificaçäo simultânea de cinco microssatélites em uma regiäo com baixa recombinaçäo no cromossomo X. A análise foi entäo feita por densitometria a laser assistida por computador. Nenhum caso de homozigosidade em todos os cinco locos foi encontrado em 30 mulheres normais estudadas, nem em 37 mulheres cuja tipagem foi extraída do banco de dados do CEPH. Além disso, todos os casos de monossomia X previamente diagnosticadas por citogenética convencional apresentaram a prevista perda de heterozigosidade. Quando estudamos 19 casos de perdas fetais femininas do primeiro trimestre da gravidez, encontramos quatro amostras uniformemente homozigotas em todos os locos (21 por cento), de acordo com a proporçäo esperada de casos de monossomia X em perdas fetais do primeiro trimestre. Concluímos que o sistema multiplex que nós desenvolvemos apresenta alta diversidade e alta eficiência de amplificaçäo pela PCR e constitui um método simples e útil de triagem para monossomia X em abortamentos e natimortos.

Diagnosis of the fragile X syndrome in males using methylation-specific PCR of the FMRI locus

We have developed a non-isotopic technique based on methylation-specific PCR (MSP) of the FMR1 promoter for the identification of fragile X full mutations among men. DNA samples were first treated with sodium bisulfite to convert unmethylated, but not methylated, cytosines to uracil, followed by PCR amplification with oligonucleotide primers specific for methylated versus unmethylated DNA. We designed two primer pairs: one produced a 142-bp fragment from the bisulfite-treated methylated CpG island, while the other generated an 84-bp product from the treated non-methylated promoter. In normal males only the 84-bp fragment was seen, while the diagnosis of FRAXA was doubly indicated by the appearance of a 142-bp product together with absence or weak visualization of the 84-bp band. As an indispensable internal control for the efficiency of the sodium bisulfite treatment, we used a primer pair specific for the imprinted maternal methylated version of the CpG island of the SNRPN gene on human chromosome 15. Using the methylation-specific PCR we identified with 100 per cent sensitivity and accuracy eight previously diagnosed FRAXA male patients mixed with 42 normal controls. Because of its simplicity and high efficiency, methylation-specific PCR may become the method of choice for the diagnosis of the fragile X syndrome in mentally retarded males.