Desenvolvimento e avaliação de um teste ELISA indireto para o diagnóstico sorológico do mormo em equídeos / Standardization and evaluation of an indirect ELISA for the serological diagnosis of glanders in horses

O mormo é uma enfermidade infecto-contagiosa de caráter agudo ou crônico que acomete principalmente os equídeos, causando enormes prejuízos na cadeia produtiva do cavalo. Para controlar a enfermidade o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) instituiu medidas sanitárias obrigatórias em todo território nacional que incluem o diagnóstico oficial pela fixação do complemento (FC), maleinização e sacrifício dos animais positivos. Os kits atuais utilizados no diagnóstico da doença são importados, dificultando e encarecendo sua aplicação na rotina. Objetivou-se com este estudo padronizar um teste de ELISA indireto utilizando o extrato protéico de Burkholderia mallei isolada a partir de equídeo portador no estado de Pernambuco. As amostras foram cultivadas em ágar sangue 10%, incubada por 48h a 37°C; posteriormente caracterizou-se fenotípica e genotipicamente uma das colônias isoladas, e em seguida a cultivou em BHI para enriquecimento; logo após, esta foi repicada para o meio Dor-set Henley o qual foi incubado a 37ºC sob 60rpm por oito semanas. Para padronização do teste utilizou-se o Conjugado Proteína G Peroxidase Sigma na diluição de 1:90.000, com soros diluídos em 1:100 e o antígeno em 1:400. Utilizou-se 60 soros como controle negativo testados frente à FC para determinação do ponto de corte o qual ficou em 0,042nm. Feitas as padronizações, foram testadas 300 amostras, onde 99% (297) foram concordantes com os resultados obtidos na FC. Ao final, o ensaio apresentou 100% de sensibilidade e 98,2% de especificidade com valores preditivo positivo e negativo de 97,7% e 100%, respectivamente. O teste de concordância kappa foi 0,98 e a repetibilidade intra e interplaca ficaram em 8,8 e 10,3%, respectivamente. Diante dos resultados obtidos durante os ensaios, conclui-se que o teste de ELISA indireto pode ser utilizado como uma ferramenta de diagnóstico eficiente. Entretanto, mais ensaios devem ser realizados visando consolidar a confiabilidade do referido teste.

Glanders is an infectious-contagious disease of acute or chronic character which principally affects horses, causing enormous losses in the productive chain of this animal. To control the disease, the Ministry of Agriculture, Husbandry and Supply instituted mandatory sanitation measures in the entire national territory which include an official diagnosis through the complement fixation (CF) test, maleinization and sacrifice of the animals that are positive. Nowadays the kits used for the diagnosis of the disease are imported, making their routine application difficult and more expensive. The objective of this study was to standardize an indirect ELISA test, using the proteic extract of Burkholderia mallei isolated from a carrier horse in the state of Pernambuco. The samples were cultivated in 10% blood agar and incubated for 48h at 37°C; later, one of the isolated colonies was characterized phenotypically and genotypically and immediately cultivated in brain heart infusion (BHI) for enrichment; then it was peaked (repicada) for the Dor-set Henley medium which was incubated at 37ºC under 60rpm for eight weeks. To standardize the test the Protein G Peroxidase Sigma Conjugate was used in the dilution of 1:90.000, with serums diluted in 1:100 and the antigen in 1:400. Sixty serums were used as negative controls, tested before the CF to determine the cutting point which was 0.042nm. After establishing the standardization, 300 samples were tested, of which 99% (297) were in agreement with the results obtained in the CF. At the end, of assay presented 100% sensibility and 98.2% specificity, with predictive (preditivo) positive and negative values of 97.7% and 100% respectively. The Kappa concordance test was 0.98 and the intra and interplac repeatability were 8.8% and 10.3% respectively. From the results obtained, it is possible to affirm that the indirect ELISA test can be used as an efficient diagnosis tool. However, more essays must be carried out to consolidate the reliability of this test.

Ocorrência e fatores de risco associados à infecção por Corynebacterium pseudotuberculosis em caprinos e ovinos do semiárido paraibano / Occurrence and risk factors associated with the Corynebacterium pseudotuberculo sis infection in sheep and goats from the semiarid region of the Paraiba state, Northeastern Brazil

Este trabalho teve como objetivo determinar a ocorrência e os fatores de risco associados à infecção por Corynebacterium pseudotuberculosis em caprinos e ovinos do semiárido da Paraiba. De 640 animais examinados, 7,7% (49/640) apresentavam evidências clínicas de linfadenite caseosa. Em 59,2% (29/49) destes animais havia apenas as cicatrizes de abscessos anteriormente rompidos; em 40,8% (20/49) dos animais, os abscessos estavam intactos. Desses 20 animais, 13 (65%) caprinos apresentaram 14 abscessos, enquanto que sete (35%) ovinos apresentaram oito abscessos. Em ambas as espécies, o linfonodo pré-escapular foi o mais acometido. No exame microbiológico, constatou-se que C. pseudotuberculosis foi o agente mais frequentemente isolado, em 15 (68,2%) amostras; em uma (4,5%) foi isolado Staphylococcus coagulase negativa; uma (4,5%) Enterococcus sp.; uma (4,5%) o Proteus mirabilis e Pseudomonas aeruginosa; e em quatro (18,2%) amostras não houve crescimento bacteriano. O modelo final de regressão logística mostrou que animais provenientes de rebanhos em que seus proprietários deixavam os abscessos romperem naturalmente tiveram maior chance de apresentar linfadenite caseosa (odds ratio =8,19; IC 95% =1,75-38,25; p=0,008). Conclui-se que os caprinovinocultores da região devem adotar medidas profiláticas em seus rebanhos, como abertura e drenagem precoce dos abscessos superficiais e destino adequado do conteúdo. Tais medidas, associadas à inspeção periódica do rebanho, descarte de animais doentes e não introdução de animais infectados, contribuirão significativamente para o controle desta infecção.

This study aimed to determine the occurrence and risk factors associated with Cory nebacterium pseudotuberculosis infection in goats and sheep in semiarid region of Paraiba State, Northeastern Brazil. Of the 640 animals examined, 7.7% (49/640) had clinical evidence of caseous lymphadenitis. In 59.2% (29/49) of these animals there was only the scars of previously ruptured abscesses and in 40.8% (20/49) of the animals abscesses were intact. Of these 20 animals 13 (65%) goats had 14 abscesses, whereas seven (35%) sheep had eight abscesses. In both species, pre-scapular lymph node was the most involved. C. pseudotuberculosis was the agent most frequently isolated, in 15 (68.2%) samples, and in one (4.5%) coagulase-negative Staphylococcus was isolated, one (4.5%) Enterococ cus sp., one (4.5%) Proteus mirabilis and Pseudomonas aeruginosa, and in four (18.2%) samples there was no bacterial growth. The final logistic regression model showed that animals from herds where their owners let the abscesses break naturally presented larger odds of caseous lymphadenitis (odds ratio = 8.19, 95% CI = 1.75 - 38.25, p = 0.008). We conclude that goat/sheep owners of the region should adopt preventive measures in their herds, such as early opening and drainage of superficial abscesses, and appropriate destination of the content. Such measures, in addition to regular inspection of the flock, disposal of diseased animals and introduction of non-infected animals will contribute to the control of this infection.

Perfil de sensibilidade microbiana in vitro de linhagens de Staphylococcus spp. isoladas de vacas com mastite subclínica / In vitro antimicrobial sensitivity to Staphylococcus spp. isolates from dairy cows with subclinical mastitis

Objetivou-se com este estudo avaliar a sensibilidade antimicrobiana in vitro de 291 isolados de Staphylococcus spp. recuperados de amostras de leite de vacas com mastite subclínica, em 15 propriedades rurais localizadas na Região Metropolitana do Recife (A), Agreste (B) e Zona da Mata (C) do estado de Pernambuco. Dos 291 isolados, 170(58,4 por cento) foram classificados como Staphylococcus coagulase negativa (SCN), 84(28,9 por cento) como Staphylococcus aureus e 37(12,7 por cento) como Staphylococcus coagulase positiva (SCP). Para o estudo do perfil de sensibilidade a antimicrobianos empregou-se a técnica de difusão em discos, foram avaliadas 16 drogas antimicrobianas utilizadas no tratamento das mastites. O antibiótico que apresentou melhor eficácia in vitro foi a associação entre neomicina + bacitracina + tetraciclina com percentuais de 98,4 por cento, 99,3 por cento, 89,7 por cento para as regiões A, B e C, respectivamente. O antibiótico menos eficaz foi a ampicilina que apresentou 56,5 por cento de resistência para as amostras da região A, 72,8 por cento para a região B e 71,8 por cento na região C. Os resultados obtidos mostram a necessidade da realização periódica de testes de sensibilidade in vitro, pois existem variações no perfil de sensibilidade e resistência que podem comprometer o tratamento do animal bem como os programas de controle da mastite bovina causada pelo Staphylococcus spp.

The objective of the investigation was to evaluate the in vitro antimicrobial sensibility of 291 isolates of Staphylococcus spp., taken from the mammary glands of dairy cows with subclinical mastitis in the regions of Metropolitan Recife (A), Agreste (B) and Zona da Mata (C) in the state of Pernambuco, Brazil. From the 291 isolates, 170 (58.4 percent) were identified as negative coagulase Staphylococcus (SCN), 84 (28.9 percent) as Staphylococcus aureus, and 37 (12.7 percent) as positive coagulase Staphylococcus (SCP). To study sensitivity to antimicrobials, the diffusion in disks method was used with 16 antimicrobial drugs commonly employed in the treatment of mastitis. The most efficient antibiotic in vitro was the combination of neomicine + bacitracine + tetracycline with percentages of 98.4 percent, 99.3 percent, and 89.7 percent for the A, B, and C regions, respectively. The least efficient was ampicillin, which was resistant to 56.5 percent of the isolates taken from region A, 72.8 percent from region B, and 71.8 percent from region C. These results indicate the need for periodic testing of sensitivity in vitro, as these variations can compromise the treatment of animals as well as control programs for bovine mastitis caused by Staphylococcus spp.