Desarrollo de un método de transcripción inversa seguida de reacción en cadena de la polimerasa para la detección del virus de la fiebre amarilla / Development of a reverse transcription polymerase chain reaction method for yellow fever virus detection

Introduction. Yellow fever is considered a re-emerging disease and is endemic in tropical regions of Africa and South America. At present, there are no standardized or commercialized kits available for yellow fever virus detection. Therefore, diagnosis must be made by time-consuming routine techniques, and sometimes, the virus or its proteins are not detected. Furthermore, co-circulation with other flaviviruses, including dengue virus, increases the difficulty of diagnosis. Objective. To develop a specific reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) and nested PCR-based assay to improve the detection and diagnosis of yellow fever virus using both serum and fresh tissue samples. Materials and methods. RT-PCR primers were designed to amplify a short fragment of all yellow fever virus genotypes reported. A second set of primers was used in a nested PCR to increase sensitivity. Thirty-three clinical samples were tested with the standardized reaction. Results. The expected amplicon was obtained in 25 out of 33 samples analyzed using this approach, and 2 more samples tested positive after a subsequent nested PCR approach. Conclusion. This improved technique not only ensures the specific detection of a wide range of yellow fever virus genotypes but also may increase the sensitivity of detection by introducing a second round of amplification, allowing a rapid differential diagnosis between dengue and yellow fever infection, which is required for effective surveillance and opportune epidemiologic measures.

Introducción. La fiebre amarilla se considera una enfermedad reemergente y endémica en regiones tropicales de África y Suramérica. Actualmente, no existen estuches estandarizados o comerciales disponibles para la detección del virus de la fiebre amarilla y, por lo tanto, el diagnóstico debe hacerse mediante técnicas de rutina que consumen mucho tiempo y algunas veces no garantizan la detección del virus o de sus proteínas. Además, la cocirculación con otros flavivirus, incluyendo el del dengue, hacen el diagnóstico más complicado. Objetivo. Desarrollar un ensayo específico de amplificación basado en transcripción inversa seguida de reacción en cadena de la polimerasa, con el fin de mejorar la detección y el diagnóstico de la fiebre amarilla, tanto a partir de suero como de tejido fresco. Materiales y métodos. Se diseñaron iniciadores específicos para amplificar un fragmento conservado del virus de la fiebre amarilla. Un segundo par de iniciadores se usó en una reacción de amplificación anidada para incrementar la sensibilidad. Se probaron 33 muestras clínicas con la técnica estandarizada. Resultados. El amplímero esperado se obtuvo en 25 de las 33 muestras analizadas usando este método y 2 más resultaron positivas después de la reacción anidada. Conclusión. Esta técnica mejorada garantiza la detección de todos los genotipos virales de fiebre amarilla y puede incrementar la sensibilidad del ensayo introduciendo una segunda etapa de amplificación, lo cual permite el diagnóstico diferencial con infección por dengue y otros flavivirus, lo cual es de gran importancia para la vigilancia y la toma de medidas epidemiológicas oportunas.

Epidemiología molecular de los virus Dengue / Molecular epidemiology of Dengue virus

El dengue es la enfermedad viral más importante transmitida por mosquitos a humanos por su alta morbimortalidad y el potencial de diseminación de su vector Aedes aegypti. Además, la falta de una vacuna y medicamentos antivirales específicos, así como el incremento progresivo de las infecciones secundarias y la hiperendemicidad en diferentes países, hacen de esta enfermedad un problema de salud pública. Existen cuatro serotipos del virus del dengue (DENV), dentro de cada serotipo se han descrito varios genotipos, constituidos a su vez por diferentes linajes o clados. La epidemiología molecular combina los análisis filogenéticos de los DENV detectados en un área geográfica, en un tiempo definido, con la información clínica y epidemiológica disponible. El objetivo de estos estudios es tratar de establecer asociaciones entre genotipos o linajes virales con el origen (ancestros), procedencia geográfica, ruta de transmisión viral, severidad de la enfermedad, grupos poblacionales afectados, y la intensidad y extensión de los brotes epidémicos. La epidemiología molecular ha generado información relevante como la etiología del DENV genotipo Asiático en los casos graves de dengue de la epidemia ocurrida en Venezuela en 1989, y la identificación de cambios nucleotídicos puntuales en el genoma viral asociados a propiedades biológicas fundamentales. En la actualidad se hace necesario realizar análisis exhaustivos del genoma viral completo, conjuntamente con el análisis bioinformático, biológico, clínico y epidemiológico de los cuatro serotipos circulantes en los países endémicos, así como instaurar en los laboratorios adscritos a los sistemas de vigilancia epidemiológica del dengue, la vigilancia molecular para la identificación de genotipos (o linajes) circulantes, lo que contribuiría entre otros aspectos al control efectivo de la enfermedad por DENV.

Dengue is the most important viral disease transmitted by mosquitoes to humans in tropical and subtropical regions of the world. This is the result of its high morbidity and mortality, the spread potential of the vector Aedes aegypti, the lack of effective vaccines and specific antiviral drugs, the gradual increase in secondary infections and hyperendemicity differences in distinct countries. There are four serotypes of dengue virus which are phylogenetically grouped in genotypes and subdivided in lineages or clades. Molecular epidemiology combines phylogenetic analysis of DENV detected in particular geographic areas within a defined time with the available clinical and epidemiologic information. The objective of these studies is to look for relationships between genotypes or lineages, viral origin, geographical spreading and routes of viral transmission, disease severity, population groups affected, and the intensity, speed and extent of outbreaks. Also, molecular epidemiology has generated relevant information such as the Asian genotype DENV etiology in cases of the severe dengue epidemic in Venezuela in 1989, and the identification of specific nucleotide changes in the viral genome associated with its fundamental biological properties. However, analysis of the complete viral genome, together with bioinformatic, biological, clinical and epidemiological analysis corresponding to the four serotypes circulating in endemic countries should be performed. Molecular surveillance for the identification of genotypes (or strains) circulating should be implemented in the laboratories responsible for the epidemiological surveillance of dengue, which would improve the effective control of DENV.

Análisis de un brote de meningitis viral en la provincia de Tucumán, Argentina / Analysis of an outbreak of viral meningitis in the province of Tucuman, Argentina

OBJETIVO: Confirmar la existencia de un brote de meningitis viral en 1996 en la provincia de Tucumán, Argentina, y estudiar sus características epidemiológicas. MÉTODOS: Se analizó información obtenida del Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica (SINAVE) del Ministerio de Salud de Argentina para el período de 1994-1998, la cual fue provista por la Dirección de Epidemiología de dicho ministerio. Para el cálculo de incidencias se usaron estimaciones poblacionales para los años 1994-1998 realizadas por el Instituto Nacional de Estadística y Censos (INDEC) sobre la base del censo de 1991. El estudio de frecuencias se realizó mediante el análisis de tablas de contingencia de doble entrada, según el método de ji cuadrado con la corrección de Yates. Se consideró significativo el resultado cuando P < 0,05. RESULTADOS: Se confirmó la presencia de un brote de 189 casos entre el 11 de febrero y el 18 de mayo de 1996. La incidencia de casos en la provincia mostró un aumento entre 1995 y 1996 (de 0,5 a 19,3 casos por 100000 años-persona) y dicha incidencia fue significativamenrte mayor que la observada en el resto del país (19,3 frente a 2,8 casos por 100000 años-persona). El 75,1 por ciento de los casos ocurrió en niños menores de 9 años (142/189). Se detectó la presencia de Enterovirus (EV) en 65 de las 111 muestras estudiadas (58,6 por ciento). Mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) anidada con transcripción inversa se logró detectar EV en 66,3 por ciento (53/80) de los casos estudiados por este método, en comparación con solo 29,6 por ciento (24/81) de los estudiados mediante aislamiento viral. Se identificó echovirus tipo 4 en 15 (68 por ciento) en las 22 muestras tipificadas (5 por aislamiento, 3 por secuenciación y 7 por ambos métodos). Este brote demuestra la capacidad de los EV para diseminarse y producir enfermedad en la población. Durante el brote, por lo menos 56 por ciento de los casos fueron hospitalizados. CONCLUSIONES: El uso de métodos moleculares permitió el diagnóstico rápido del virus etiológico y posibilitó un mejor control del brote. El reconocimiento temprano de este podría haber evitado la mayoría de las hospitalizaciones y el uso indiscriminado de antibióticos