Desempeño de métodos moleculares para la identificación de subtipos poco comunes del virus de la hepatitis C, genotipo 2 / Performance of molecular methods for identification of unusual subtypes of hepatitis C virus genotype 2

Resumen Introducción. El virus de la hepatitis C (HCV) presenta una gran variabilidad genética, con siete genotipos y numerosos subtipos. La determinación del tipo viral ha sido fundamental para la escogencia y la duración del tratamiento antiviral adecuado. En Venezuela, el genotipo 2 del HCV es relativamente diverso, siendo particularmente prevalente el subtipo 2j. Objetivo. Evaluar el desempeño de las metodologías para la determinación del genotipo del HCV, particularmente para la identificación del subtipo 2j. Materiales y métodos. Se determinaron el genotipo y el subtipo del HCV mediante la técnica de hibridación inversa LiPA (Line Probe Assay) y secuenciación de las regiones genómicas 5'NC y NS5B del virus. Resultados. En 65 muestras analizadas, la metodología basada en la amplificación de la región 5'NC mostró mayor sensibilidad (100 %), en comparación con la técnica LiPA (91 %) y la secuenciación de la región NS5B (77 %). La determinación de genotipo, tomando como método de referencia la secuenciación de NS5B, mostró un alto grado de concordancia para la secuenciación de la región 5´NC y la hibridación inversa LiPA, con 100 % en la asignación de genotipos, comparado con 70 % y 66 % para los subtipos, respectivamente. La secuenciación de la región NS5B permitió identificar los subtipos 2j y 2s, los cuales no fueron detectados por las otras metodologías. No se observó un patrón característico para las muestras subtipo 2j en la hibridación inversa LiPA. Conclusión. Aunque es la metodología con menor sensibilidad, la secuenciación de la región NS5B es una herramienta poderosa para la correcta discriminación de los distintos subtipos circulantes del HCV, lo cual reviste importancia epidemiológica.

Abstract Introduction: Hepatitis C virus (HCV) displays high genetic variability, with seven genotypes and numerous subtypes. The determination of the viral type has been essential for the selection and timing of antiviral treatment. In Venezuela, HCV genotype 2 is relatively diverse, being particularly prevalent subtype 2j. Objective: To evaluate the performance of methodologies for genotyping HCV, particularly for identification of subtype 2j. Materials and methods: HCV genotype and subtype were determined by reverse hybridization technique (LiPA) and sequencing of the HCV 5'UTR and NS5B regions. Results: A total of 65 samples from HCV-infected patients were analyzed. PCR amplifications of the 5'UTR region exhibited the highest sensitivity (100% vs 91% for LiPA and 77% for NS5B). Genotype determination, taking as reference test NS5B, showed 100% concordance with the other methods, and 67% and 59% for subtypes with 5´NC and LiPA, respectively. NS5B sequencing allowed the identification of subtypes 2j and 2s, which were not detected by the other methods. A specific LiPA pattern was not observed for HCV subtype 2j. Conclusion: Although being the methodology with lowest sensitivity for amplification of HCV RNA, sequencing NS5B region remains a powerful tool for correct discrimination of the different HCV subtypes, which is of epidemiological relevance.

Efecto de la proteína E2 del virus de hepatitis C sobre la activación de células NK / Effect of E2 protein of hepatitis C virus on the activation of NK cells

En estudios previos, se ha descrito un disminución de la activación y actividad citotóxica de las células NK en los pacientes infectados con hepatitis C; sin embargo, se desconoce el mecanismo por el cual éste fenómeno ocurre. En el presente reporte se estudió el efecto de la proteína E2 de la envoltura del virus o de la estimulación de su receptor con el anticuerpo anti-CD81 sobre la fosforilación de tirosinas, serinas, las enzimas: proteína quinasa C y fosfoinositol 3 quinasa, el factor de transcrición Nfkb y el intercambiador de nueclotidos VAV de células NK de controles normales estimulados con anti-CD16. Ambos, la proteína E2 y anti-CD81, combinado o por separado inducen una disminución de la fosforilación de tirosinas y serinas, así como una marcada disminución de la fosforilación de PKC, NFkB, PI3K y en menor grado VAV. Se concluye que la proteína E2 sola y en conjunto con anti-CD81 inducen señales inhibitorias responsables de la disminución en la activación de las células NK de pacientes infectados por el VHC y que éste fenómeno puede ser responsable de la cronicidad que se reporta en dicha enfermedad

The decrease in NK cell activation and cytotoxic activity in patients infected with hepatitis C virus has been described; however, the mechanism by whcih this phenomenon occurs is not known. In the present report, the effect of the E2 protein of the virus envelope or the stimulation of its receptor CD81 with the antibody anti-CD81 on the phosphorylation of tyrosines, serine, the enzymes protein kinase C, phosphoinositol kinase 3 (PI3K), the transcription factor NfkB and the nucleotide exchange protein VAV was assessed in NK cells from normal controls stimulated with anti-CD16. Both the protein E2 and anti-CD81 by themselves or combined, generated a decrease in tyrosine, serine, and a marked decrease in the phosphorylation of PKC, NfkB, PI3k and in less extent in VAV. It is concluded that the E2 protein alone and combined with anti-CD81 induce inhibitory signals responseible for the decrease in the activation of NK cells of infected HCV patients and it could be responsible for the chronicity observed in this disease

Polimorfismos de receptores semejantes a Toll 2 y 4 en pacientes con asma bronquial y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) / Polymorphisms of Toll-like receptors 2 and 4 in patients with bronchial asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD)

Los receptores semejantes a Toll forman parte del sistema inmune. Algunas mutaciones en estos receptores se han relacionado con el desarrollo de enfermedades como el asma bronquial y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Se realizó un estudio de casos-controles, en el que se incluyeron 100 pacientes con asma bronquial, 100 pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica y 100 controles. A través de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa, se investigó la presencia de polimorfismos en TLR2 (Arg677Trp y Arg753Gln) y TLR4 (Asp299Gly y Thr399Ile) y su asociación con asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Se demostró la presencia de polimorfismos en TLR4 con una frecuencia del 9 por ciento en cada grupo de estudio. No se observó relación alguna entre la presencia de polimorfismos en TLR4 y los índices de gravedad para asma bronquial o enfermedad pulmonar obstructiva crónica. La gravedad de los pacientes con asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica no está relacionada con los polimorfismos en TLR 4

Toll like receptors are important in the inflammatory immune response. Several mutations of these receptors have been related to the development and chronicity of different inflammatory diseases as bronchial asthma and obstructive pulmonary disease. A case control study was performed, 100 patients with bronchial asthma, 100 obstructive pulmonary disease and 100 controls. Restriction based polymorphism PCR analysis was performed for TLR2 (Arg677Trp and Arg753Gln) and TLR4 (Asp299Gly and Thr399Ile) genes and its association with asthma and obstructive pulmonary disease was assessed. The frequency of TLR4 polymorphism was 9 percent in each group studied (asthma, obstructive pulmonary disease and controls). No association was found among TLR4 polymorphism and stage of disease for asthma or obstructive pulmonary disease. TLR4 polymorphism are not associated with the presence or severity of asthma or obstructive pulmonary disease in the Venezuelan population

Reacción en cadena de la Polimerasa cuantitativa en tiempo real: Un ensayo esencial para la definición y el manejo de la Hepatitis Crónica B

Introducción: la gran demanda de un método confiable, reproducible, específico y altamente sensible para la cuantificación de ácidos nucleicos (ADN/ ARN), marcó el desarrollo de los ensayos de Reacción en Cadena de la Polimerasa cuantitativa (RCPc) en tiempo real. Objetivo: descripción y análisis de la RCPc en tiempo real para la definición y el manejo actual de los pacientes con hepatitis crónica B (HCB). Material y Método: fueron investigadas cuarenta muestras de suero provenientes de portadores conocidos del VHB empleando RCPc tiempo real mediante el sistema Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia). Resultados: el sistema utilizado para RCPc tiempo real detecta secuencias de ADN VHB en un amplio rango que puede ser expresado tanto en copias/ml como en UI/ml. Su aplicación permite la clasificación final de los diferentes portadores del VHB, ilustrándose su utilidad en el seguimiento secuencial de aquellos pacientes con HCB en tratamiento. Conclusión: la detección y la medición de secuencias de ADN VHB, en muestras clínicas de suero mediante RCPc en tiempo real, aporta mayor sensibilidad y precisión para definir la historia natural y el estado de replicación viral de los portadores crónicos del VHB antes, durante y posterior al tratamiento.

Introduction: The great need of a reliable, reproducible, specific and highly sensitive method to detect nucleic acids (DNA/RNA), induced the development of real-time quantitative assays based on polymerase chain reaction (real time PCRq). Objective: Description and analysis of a real time PCRq assay for the definition and management of patients with chronic hepatitis B (CHB). Material and Method: Forty serum samples from known HBV carriers were investigated employing real-time PCRq by means of a Rotor-Gene 3000 system (Corbett Research,Sydney,Australia). Results: the system for realtime PCRq detects a wide range of HBV DNA sequences which could be expressed either in copies/mL or in IU/mL .Its application allows the final classification of different HBV carrier status. An illustration of its usefulness in the sequential follow-up of patients on treatment for CHB is made. Conclusion: the detection and measure of HBV DNA sequences in clinical serum samples through real-time PCRq is more sensitive and exact to define the natural history and the status of viral replication in HBV chronic carriers before, during and after treatment.

Identificación de histoplasma capsulatum en muestras clínicas mediante la técnica de PCR en dos rondas / Detection of histoplasma capsulatum by nested-PCR in clinical specimens

La histoplasmosis es una micosis profunda de distribución mundial cuyo diagnóstico se fundamenta en estudios clínicos, micológicos e inmunológicos. La identificación del agente etiológico en muestras biológicas es difícil de realizar. Se evaluó la técnica de PCR en dos rondas para identificar ADN de Histoplasma capsulatum en muestras clínicas (sangre y médula ósea) y cultivos del hongo. Se ensayaron 3 métodos de aislamiento de ADN basados en los reactivos Tiocianato de Guanidina, Cloruro de Bencilo y Triton-X-100. La técnica de aislamiento con Tiocianato de guanidina resultó de fácil aplicación en muestras clínicas. Sin embargo, se obtuvo un mayor rendimiento de ADN con el reactivo Triton-X-100. La aplicación de la prueba de PCR generó un amplificado de 210 pares de bases el cual fue identificado tanto en las cepas de referencia de H. capsulatum como en 5 muestras de sangre y 2 muestras de médula ósea. Para confirmar la especificidad de la prueba se analizaron cepas de otros hongos no relacionados, Paracoccidioides brasiliensis, Candida glabrata, Cryptococcus neoformans y Coccidioides immitis (C posadasii) las cuales resultaron negativas. La técnica de PCR mostró una sensibilidad de hasta 10pg de ADN de H. capsulatum confirmándose así su utilidad como herramienta de diagnóstico molecular.

Expresión de los receptores para el Fc de la IgG en leucocitos de sangre periférica de pacientes con hepatitis C crónica / Expression of Fc receptors for IgG in peripheral blood leucocytes from hepatitis C virus infected individuals

La respuesta inmunitaria representa un elemento fundamental en el control de la infección por el Virus del Hepatitis C (VHC). Factores de origen viral y del hospedero modulan dicha respuesta. El presente trabajo tuvo como objetivo caracterizar complejos inmunitarios, bajo la forma de crioglobulinas, de pacientes infectados con el VHC y evaluar la expresión de superficie de los receptores para el Fc de la IgG (FcyR)COLOCARSIGNO en subpoblaciones leucocitarias de sangre periférica de estos pacientes. Se seleccionaron 12 individuos VHC (+) y 12 sujetos sanos. De ambos grupos se tomaron muestras de suero para aislar crioglobulinas y sangre venosa con EDTA para evaluar la expresión e los FcyR CD64 (FcyRI), CD32 (FcyRII) y CD16 (FcyRIII) mediante citometr¡a de flujo. La presencia de ARN del VHC en suero y crioglobulinas fue analizada mediante RT-PCR. Los resultados muestran que el 50 por ciento de los pacientes VHC (+) presentaron niveles elevados de crioglobulinas constituidas fundamentalmente por IgG. En 3 de 5 pacientes con crioglobulinas elevadas se identificó ARN del VHC. La expresión de CD64 se observó principalmente en monocitos (80 por ciento), CD32 en monocitos, linfocitos B y neutrófilos (>90 por ciento) y CD16 en células NK y neutrófilos (85 por ciento y 95 por ciento respectivamente) no encontrándose diferencias significativas entre pacientes y controles. La densidad de expresión de CD32 resultó significativamente menor en poblaciones de monocitos y neutrófilos de pacientes en comparación con controles (p<0,05). Se concluye que esta disminución en la densidad del receptor FcyRII podría tener implicaciones en la fisiopatología de la infección por el VHC.

Estudio de 40 casos de Histoplasmosis en niños y revisión de la literatura / Study of 40 cases of histoplasmosis in children and literature review

En niños, la histoplasmosis es la micosis profunda más frecuente en nuestro país. No es de denuncia obligatoria, por lo que existe un gran subregistro. El objetivo de este trabajo es reportar los casos de histoplasmosis diagnosticados en niños en la Sección de Micología Médica del Instituto de Medicina Tropical (IMT). Universidad Central de Venezuela (UCV), entre julio 2004 y julio 2005, con la finalidad de dar a conocer los principales aspectos de esta entidad a la población médica, en especial a los pediatras. Se evaluaron los pacientes en edad pediátrica (0-18 años) que fueron traídos a la consulta de la Sección y las muestras biológicas que se recibieron en el lapso antes mencionado. Se realizó examen mitológico y se siguió la evolución con el tratamiento. Se encontraron 40 casos de histoplasmosis con edades comprendidas entre 14 días y 16 años, 15 del genero femenino y 25 del genero masculino. Seis eran menores de 1 año, la mayoría (25 casos) provenientes del Distrito capital. Dieciocho presentaron la forma de histoplasmosis diseminada de los cuales 4 fallecieron. Quince presentaron la forma pulmonar aguda y 5 meningitis crónica. Seis pacientes estaban desnutridos, 4 presentaron VIH y 4 tenían tuberculosis. En 18 pacientes se desconoce comorbilidad. Nueve pacientes tenían aumento de la VSG, 7 anemia, 5 leucopenia y 2 pancitopenia. Los datos epidemiológicos fueron sugestivos de histoplasmosis en todos los casos. Se reportaron 40 casos de histoplasmosis en niños, diagnósticados en la Sección de Micología Médica del IMT-UCV. La forma clínica más frecuente fue la histoplasmosis diseminada. Ante la presencia de niños con las características descritas, debe pensarse en histoplasmosis como diagnóstico diferencial, relacionando la epidemiología, clínica, radiología y exámenes de laboratorio. Es necesario practicar mitológico para confirmar la presencia de esta enfermedad.

Biología molecular del virus de hepatitis C / Molecular biology of the hepatitis C virus

El virus de la hepatitis C (VCH) representa un nuevo miembro de la familia flaviviridae cuya caracterización molecular ha sido llevada a cabo en los últimos cinco años. La partícula viral consiste de una envoltura de naturaleza lipoprotéica, derivada de la membrana de la célula hospedera, que contiene los dos principales polipéptidos estructurales designados como el E1 y E2. La envoltura rodea la nucleocápside, estructura constituida principalmente por una proteína básica que está en estrecha interacción con el genoma viral representado por una molécula de ARN de cadera sencilla polaridad positiva con una longitud apróximada de 9.600 nucleótidos. La organización genómica del VCH es similer a la de Pestivirus y Flavivirus, Ubicándose las secuencias que codifican para las proteínas estructurales hacia el extremo 5 y las que codifican las proteínas estructurales hacia el extremo 3 del genoma. Ambos tipos de polipéptidos son generados a partir de una poliproteína de 3.000 aa que es procesada proteolíticamente por enzimas de origen celular y viral. Dos regiones no codogénicas se identifican hacia los extremos 5 y 3 del genoma y se caracterizan por presentar secuencias altamente conservadas que parecen fundamentales en el proceso replicativo del virus

Respuesta inmunológica en hepatitis viral / Immune response in viral hepatitis

Los virus de la hepatitis A, B, y C constituyen tres de los principales agentes hepatotrópicos mejor caracterizados desde el punto de vista estructural y molecular. El estudio de la biología de estos virus ha permitido comprender ciertos aspectos relacionados con la fisiopatología y la respuesta inmune en estas infecciones virales. En los tres modelos de infección se describe una respuesta humoral específica dirigida hacia distintos componentes antigénicos de las partículas virales y que pudiera resultar efectiva en el control de la infección. En algunos casos, comola infección por el VHB, el patrón de la respuesta humoral puede correlacionarse con la condición clínico-patológica del paciente infectado. El componente celular de la respuesta inmune resulta también fundamental en el control de la infección viral. Este tipo de respuesta es mediada principalmente por linfocitos T, los cuales reconocen antígenos viarles específicos. Así mismo, dicha respuesta puede ser responsable del año histopatológico que se evidencia en las infecciones por el VHB y el VHC

Embarazo ectópico tubárico- manejo actual-

Objetivo: Se quiere presentar la experiencia en el manejo del embarazo ectópico tubárico en una institución de salud privada, utilizando todos los recursos diagnósticos y terapéuticos disponibles en la actualidad tales como endosonografía vaginal, videohisterolaparoscopia y videosalpingoscopia para el manejo de esta patología. Diseño: Se evaluaron 26 pacientes con diagnóstico de embarazo ectópico que llegaron al programa de medicina reproductiva de la Clínica de la Mujer durante un período de 14 meses. Material y Métodos: De 26 pacientes con diagnóstico de embarazo ectópico tubárico dada por la determinación de una ausencia de saco gestacional intrauterino con endosonografía vaginal (SHIMADZU SL 310 MHZ) y medición sérica de hCG.(Elisa, Sunrise Labs CA.USA) con valores superiores a 500 m/UI hCG. Dieciséis pacientes(61.5 por ciento) presentaron embarazo ectópico tubárico MUERTO(valores de hCG en meseta o en descenso y ausencia de embriocardia por endosonografía), 8 pacientes (30.7 por ciento) embarazo ectópico tubárico VIVO(valores de hCG en ascenso y/o visualización de embriocardia por endosonografía), 2 pacientes (7.7 por ciento) embarazo ectópico VIVO y ruptura tubárica como hallazgo videolaparoscópico. Conclusión: El diagnóstico precoz y manejo adecuado del embarazo ectópico permite disminuir morbilidad, hospitalización y costos así como mejorar el pronóstico de fertilidad de estas pacientes, con una infraestructura mínima y de relativo bajo costo(truncado 2500 caracteres)

Spleen and thymus histology and proliferative response of splenic cells in rats fed raw and cooked Phaseolus vulgaris beans

Histological studies of the spleen and thymus of rats fed raw black beans (Phaseolus vulgaris) show an atrophy of both lymphoid organs. Decrease in relative thymus weight was most marked. All histological organization of this organ appeared altered. An evident decrease in cell number was also observed in both organs. Proliferative response of splenic cells stimulated in vitro with Concanavalin A was increased as compared to that from animals fed the control diet. It is likely that histological changes observed in the spleen and the thymus are due mainly to a protein caloric deficiency, although the possibility that toxic factors present in the raw diet have an effect on the immune system of the rat can not be overruled

Evaluacion de un ensayo de hibridizacion molecular para la deteccion de ADN circulante del virus de hepatitis B: correlacion inmunoclinica / Evaluation of a molecular hyBridization trial for the detection of circulating DNA of hepatitis B virus: immunoclinical correlation

Correlación inmunoclínica del ADN viral circulante del VHB fue realizada utilizando para su detección la técnica de hibridización en fasefluída y una sonda de ADN complementario marcada con I125 (Abbott-Genostics TM). La correlación se practicó en 12 sueros incluyendo 8 de portadores comprobados del VHB con o sin enfermedad hepática. Sólo los sueros sin enfermedad hepática. Sólo los sueros AgeHB positivos demostraron presencia de ADN viral circulante en rangos de 60 a 2800 pcg/ml. El ensayo resultó de relativo fácil manejo; sin embargo el alto costo y el uso de un radioisótopo de vida media corta limita su uso rutinario, encontrándose aún bajo investigación su aplicabilidade clínica. Se discute la significancia inmunopatológica de los hallazgos

Técnicas de biología molecular para la detección del virus de la hepatitis Delta. I: obtención de la sonda diagnóstica específica / Molecular biology techniques for detection of delta hepatitis virus. I: obtaining the specific diagnostic probe

Una sonda específica para la detección de genomas del VHD fue desarrollada a partir del plásmido recombinante pa-1. La sonda fue marcada mediante un método no isotópico, lo cual permite el almacenaje prolongado de la misma