Histological and immunohistochemical evaluation of two cell therapy protocols in equine suspensory ligament repair / Avaliação histológica e imunoistoquímica do reparo do ligamento suspensório equino tratado com dois protocolos de terapia celular

This study aimed to histologically evaluate the quality of tissue repair in equine suspensory ligament treated with two cell therapy protocols. All four limbs of six animals were operated simultaneously to remove a fragment in each ligament using a skin biopsy punch. Two days later, intralesional injections were performed using bone marrow mononuclear fraction (BM group), cultivated cells derived from adipose tissue (AT group), saline (positive control group), or no treatment (negative control group), in such way that each horse received all treatments. After sixty days biopsies were performed for histological analysis (H & E, Masson's trichrome and picrosirius red) and immunohistochemistry analysis (collagen type III). Histological findings (H & E and Masson's trichrome), birefringence intensity (through picrosirius) and collagen type III expression (through immunohistochemistry) were analyzed. Samples from treated groups had better birefringence intensity (P=0.007) and fiber alignment scores were superior compared to controls, though not statistically significant (P=0.08). Presence of inflammatory cells and intense staining for collagen type III occurred in all groups demonstrating an active healing process. In conclusion, both protocols resulted in improvement of tissue repair indicating their potential to be used as an adjuvant treatment of equine suspensory ligament disorders.(AU)

Este estudo teve como objetivo a avaliação histológica e imunoistoquímica do reparo do ligamento suspensório equino tratado com dois protocolos de terapia celular. Os quatro membros dos seis animais do experimento foram submetidos a procedimento cirúrgico em que um fragmento de cada ligamento foi retirado, utilizando-se punch de biópsia. Dois dias após o procedimento, aplicações intralesionais foram realizadas, por meio de aspirado de medula óssea (bone marrow-BM), células mesenquimais derivadas de tecido adiposo (adipose tissue-AT), solução salina (positive control group-PC) ou controle (negative control-NC). Após 60 dias, biópsias foram retiradas da região de reparo dos ligamentos e foram submetidas à análise histológica (HE, tricrômio de Masson, picrosírius red) e imunoistoquímica (colágeno tipo III). Diferentes variáveis histológicas (HE e tricrômio de Masson), a intensidade de birrefringência das fibras colágenas (picrosírius red) e a expressão de colágeno tipo III foram avaliadas. Os grupos tratados apresentaram maior birrefringência (P=0,007) e alinhamento de fibras (P=0,08) comparados ao controle, para o qual o resultado não se mostrou estatisticamente significativo. Achados histológicos e imunoistoquímicos demonstraram um processo ativo de reparo tecidual em todos os grupos. Concluiu-se que os dois protocolos de terapia celular apresentaram melhora no reparo tecidual, demonstrando potencial terapêutico adjuvante no tratamento de afecções do ligamento suspensório equino.(AU)

Efeito de anti-inflamatórios não esteroidais na apoptose de células epidermais lamelares de equinos com laminite / Effect of nonsteroidal anti-inflammatory drugs on apoptosis of epidermal lamellar cells of equines with laminitis

O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da administração dos anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) cetoprofeno, fenilbutazona e flunixin meglumine sobre o índice apoptótico de células epiteliais do tecido lamelar de cavalos com laminite induzida por administração de amido. Foram empregados 20 equinos hígidos, divididos em quatro grupos experimentais (n=5): solução salina, cetoprofeno, fenilbutazona e flunixin meglumine. O tecido lamelar foi coletado por biópsia, fixado e corado pela técnica de TUNEL. À marcação positiva por essa técnica adicionou-se a avaliação morfológica celular para identificação da apoptose. Não houve diferença significativa no índice apoptótico entre os grupos tratados com anti-inflamatórios e o controle (P>0,05). Os anti-inflamatórios não interferiram sobre o índice apoptótico possivelmente porque foram administrados após a fase prodrômica da laminite e/ou porque não são eficazes em alterar a dinâmica da apoptose. Concluiu-se que a administração de anti-inflamatórios não esteroidais após a fase prodrômica da laminite não contribui para uma intervenção no curso da apoptose no tecido lamelar de cavalos com laminite quando comparados ao grupo controle não tratado. Outros estudos, com diferentes períodos de avaliação, são necessários para esclarecer os efeitos dos anti-inflamatórios não esteroidais na fisiopatologia da laminite em equinos, especialmente no que concerne à participação da apoptose.

The aim of this study was to evaluate the influence of the administration of anti-inflammatory drugs (NSAIDs) ketoprofen, phenylbutazone and flunixin meglumine on the apoptotic index of the epithelial cells of lamellar tissue of horses with induced laminitis. 20 healthy horses were employed and underwent induction of laminitis by administration of starch, divided into four groups with induced laminitis (n = 5): saline, ketoprofen, phenylbutazone and flunixin meglumine. The lamellar tissue was collected by biopsy, fixed and stained with the TUNEL technique. All that were stained positive by this technique were added to the cell morphological identification of apoptosis. No significant difference was found in the apoptotic index between the groups treated with anti-inflammatory and controls (P> 0.05). It was concluded that the administration of NSAIDs after the prodromal phase of laminitis does not contribute to an intervention in the course of apoptosis in the lamellar tissue of horses with laminitis when compared to the untreated control group. Other studies with different evaluation periods are needed to clarify the effects of anti-inflammatory non-steroidal drugs in the pathophysiology of laminitis in horses, especially regarding the role of apoptosis.

Histopathological characterization of experimentally induced cutaneous loxoscelism in rabbits inoculated with Loxosceles similis venom

Envenomation by Loxosceles bites is characterized by dermonecrotic and/or systemic features that lead to several clinical signs and symptoms called loxoscelism. Dermonecrotic lesions are preceded by thrombosis of the dermal plexus. Recent studies show that atheromatous plaque is prone to thrombosis due to endothelial cell apoptosis. To the best of our knowledge, there are no reports of microscopic dermal lesion and endothelial cell apoptosis induced by Loxosceles similis venom in the literature. Thus, the aim of the present study is to describe histological lesions induced by L. similis venom in rabbit skin and to elucidate whether apoptosis of endothelial cells is involved in the pathogenesis of loxoscelism. Forty male rabbits were split into two groups: the control group (intradermally injected with 50 µL of PBS) and the experimental group (intradermally injected with 0.5 µg of L. similis crude venom diluted in 50 µL of PBS). After 2, 4, 6 and 8 hours of injection, skin fragments were collected and processed for paraffin or methacrylate embedding. Sections of 5 µm thick were stained by HE, PAS or submitted to TUNEL reaction. Microscopically, severe edema, diffuse heterophilic inflammatory infiltrate, perivascular heterophilic infiltrate, thrombosis, fibrinoid necrosis of arteriolar wall and cutaneous muscle necrosis were observed. Two hours after venom injection, endothelial cells with apoptosis morphology were evidenced in the dermal plexus. Apoptosis was confirmed by TUNEL reaction. It seems that endothelial cell apoptosis and its consequent desquamation is an important factor that induces thrombosis and culminates in dermonecrosis, which is characteristic of cutaneous loxoscelism.

Cell proliferation markers in the transplanted canine transmissible venereal tumor / Marcadores de proliferação celular no tumor venéreo transmissível canino transplantado

Adult male mongrel dogs were subcutaneously transplanted with the canine transmissible venereal tumor (TVT) on the hypogastric region. Twelve specimens of tumors were collected, half during the proliferative phase and the other half during the regressive phase. Fragments of the tumor were fixed in 10 percent buffered formalin and routinely processed for light microscopy. Sections of 4µm were stained by Schorr or AgNOR or either immunostained for MIB1 (Ki67). Schorr stain, AgNOR and MIB1 showed an increased proliferative activity through mitotic index, nuclear argyrophilic protein stain and cycling tumoral cells in the growing tumors, respectively. All of the three cell proliferation markers were able to distinguish the TVT in both evolution phases. MIB1 monoclonal antibody was the best in the morphologic evaluation of growth and regression of TVT. This resulted in higher values than AgNORs counting and mitotic index. MIB1 immunostaining was the most effective parameter of the proliferative activity of TVT. However, a significant correlation has been detected only between mitosis counting and AgNORs.

Cães machos, adultos, mestiços, foram transplantados com células do tumor venéreo transmissível canino (TVTC), na região hipogástrica. Foram coletados doze espécimes do TVTC, sendo metade durante a fase proliferativa e metade durante a fase regressiva. Fragmentos do tumor foram fixados em formol a 10 por cento, tamponado e processado rotineiramente para microscopia de luz. Secções de 4µm foram coradas pelo Shorr, ou pela AgNOR, ou ainda, imunocorado para MIB 1 (Ki67). As colorações pelo Shorr, AgNOR, ou MIB 1 mostraram um aumento do índice mitótico, coloração da proteína argirofílica nuclear e células tumorais ciclando em tumores em crescimento, respectivamente. Todos os três marcadores de proliferação celular foram capazes de distinguir o TVTC em ambas as fases de evolução. O anticorpo monoclonal MIB 1 foi o melhor na avaliação morfológica, de crescimento e regressão do TVTC. Isto resultou em um valor maior que a contagem de AgNOR e do índice mitótico. A imunomarcação com MIB1 foi o parâmetro mais efetivo da atividade proliferativa. No entanto, só foi observada uma correlação positiva entre a contagem de mitose e a AgNOR.

Neurological disorder in cattle associated with bovine herpesvirus 4 / Desordem neurológica em bovinos associada ao herpevírus bovino 4

A nested PCR assay was used to diagnose bovine encephalitis through herpesviruses including bovine herpesvirus 5 (BHV-5), bovine herpesvirus 1 (BHV-1), Aujeszky's disease virus (SHV-1), and ovine herpesvirus 2 (OHV-2) in 14 fragments of central nervous system (CNS) from cattle that died with neurological signs. In addition, as some samples of bovine herpesvirus type 4 (BHV-4) have been isolated from neural tissue, it was also tested by nested PCR. The cases of encephalitis occurred in isolation at different times of the year and did not present any seasonality. The duration of the clinical course ranged between 1 to 15 days, and in 64.3 percent of the cases it manifested between 1 to 2 days. The most frequently observed neurological signs were ataxia, recumbency, unsteadiness and inability to stand, opisthotonus, paddling movements, nystagmus and ptyalism. In the nested assay, there was no evidence of: BHV-1, SHV-1 or OHV-2 in the DNA obtained from the CNS in any of the samples. But the presence of BHV-4 was found in all fragments of the CNS in cattle which died presenting neurological signs. Moreover, BHV-5 was found in association with BHV-4 in two of these samples.

Nested PCR foi utilizada para o diagnóstico de encefalite bovina por herpesvírus incluindo o herpesvírus bovino 5 (BHV-5), o herpesvírus bovino 1 (BHV-1), o vírus da doença de Aujeszky (SHV-1) e o herpesvírus ovino 2 (OHV-2) em 14 fragmentos do sistema nervoso central (SNC) de bovinos que morreram com sinais neurológicos. Embora o BHV-4 não seja reconhecido como vírus neurotrófico, foi detectado nos casos de encefalite que ocorreram isoladamente em diferentes épocas do ano e não apresentaram nenhuma sazonalidade. A duração do curso clínico variou entre 1 e 15 dias, e em 64,3 por cento dos casos manifestou-se entre 1 e 2 dias. Os sinais neurológicos mais freqüentemente observados foram ataxia, apatia, instabilidade, opistótono, movimentos de pedalagem, nistagmo e sialorréia. Nos ensaios de PCR nested realizados a partir do DNA obtido do SNC, não foi encontrado evidência de: BHV-1, SHV-1 ou OHV-2 em nenhuma das amostras. Mas, a presença de BHV-4 foi encontrada em todos os fragmentos do SNC de bovinos que morreram com sinais neurológicos. Além disso, o BHV-5 foi encontrado em associação com o BHV-4 em duas dessas amostras.

Pancreatite crônica intersticial e caquexia causada por Eurytrema coelomaticum em vaca Nelore / Chronic interstitial pancreatitis and chronic wasting disease caused by Eurytrema coelomaticum in Nelore cow

A euritrematose bovina, causada por Eurytrema coelomaticum, tem sido relatada no Brasil. A doença pode afetar animais domésticos, incluindo ruminantes. Estes parasitos geralmente vivem nos ductos pancreáticos e ocasionalmente nos ductos biliares. Este estudo relata um quadro de caquexia em um bovino parasitado por E. coelomaticum proveniente de um rebanho de gado de corte localizado no Estado de Minas Gerais. O animal acometido apresentou perda progressiva de peso, glicosúria e cetonúria. Na necropsia o pâncreas apresentava-se diminuído de tamanho, brancacento, intensa e difusamente firme (fibrose). Vários ductos apresentavam-se dilatados e repletos de Eurytrema. Microscopicamente foi observada destruição extensa do parênquima pancreático e fibrose, ovos e parasitas intralesionais, hiperplasia ductal e inflamação multifocal crônica. Este relato descreve a perda progressiva de peso e pancreatite crônica associada a E. coelomaticum em bovino de corte no Estado de Minas Gerais.

Inflammatory response, parasite load and AgNOR expression in ear skin of symptomatic and asymptomatic Leishmania (Leishmania) chagasi infected dogs

The skin has an important role in the transmission of visceral leishmaniasis (VL) as the infection pathway in dogs. To better characterize the inflammatory response of intact skin in VL, sixty infected dogs (30 symptomatic and 30 asymptomatic) and six non-infected controls were studied. Diagnosis of visceral leishmaniasis was confirmed by RIFI and ELISA; direct visualization of the parasite in bone marrow aspirate; imprints of popliteal lymph nodes, spleen, liver and skin; culture in NNN-phase liquid Schneider's medium; and PCR (performed only in the ear skin). Amastigote forms of the parasite in intact skin were found only in symptomatic dogs. Inflammatory infiltrates were observed in all groups, varying from intense and/or moderate in symptomatic to discrete and/or negligible in asymptomatic and control animals. Parasite load was associated with the intensity of the inflammatory response and with clinical manifestations in canine visceral leishmaniasis. AgNOr as active transcription markers were expressed in inflammatory cells and within apoptotic bodies in all groups, including controls, with no statistical difference. Therefore, cell activation and transcription do occur in both symptomatic and asymptomatic canine visceral leishmaniasis and may result in more necrosis and inflammation or in apoptosis and less symptoms, depending on the parasite load.

Apoptose e expressão de Bcl-2 e das caspases 3 e 8 em placenta bovina, em diferentes estádios de gestação / Apoptosis and expression of Bcl-2 and caspases 3 and 8 in placenta of cows at different pregnancy stages

Apoptose e seus mecanismos reguladores são eventos fisiológicos cruciais para a manutenção da homeostase placentária, e o desequilíbrio desses processos pode comprometer a função placentária e, consequentemente, o sucesso da gravidez. Neste estudo, investigou-se a apoptose utilizando-se histomorfometria em lâminas coradas em HE e submetidas à reação de TUNEL. Além disso, avaliou-se a expressão de Bcl-2 e das caspases 8 e 3, pela reação de polimerase em cadeia em tempo real, em placentas saudáveis em diferentes estádios de gestação. Amostras de placentônios de vacas com quatro, seis e nove meses de gestação foram colhidas e processadas. O índice apoptótico aumentou progressivamente com o avanço da gestação. Tanto o Bcl-2 quanto as caspases 3 e 8 foram expressas nos três períodos estudados, sendo a expressão de Bcl-2 menor que a de caspase 8, que é menor que a de caspase 3. Estes resultados indicam que essas moléculas estão envolvidas na via apoptótica ativada na maturação placentária, exibindo um padrão de expressão ao longo da gestação e contribuindo para o equilíbrio fisiológico da celularidade e renovação celular na placenta bovina.

Apoptosis and its regulating mechanisms are crucial physiological events for the maintenance of the placental homostasis; and disequilibrium of these processes may compromise placental function and the success of the pregnancy. In this study, apoptosis was investigated by histomorphometry using slides stained with HE and TUNEL reaction. Besides that, Bcl-2 and caspases 8 and 3 expression were evaluated by real time polymerase chain reaction in healthy placentas under different gestacional ages. Samples of placentones of cows at 4th, 6th, and 9th months of gestation were harvested and processed. The apoptotic index gradually increased with the advance of the gestation. Bcl-2 and caspases 3 and 8 were expressed in all the studied periods, being the expression of Bcl-2 lower than that of caspase 8, which was lower than caspase 3. These results indicate that these molecules are involved in the activated apoptotic way in the placental maturation, showing a standard expression throughout the gestation and contributing for the physiological balance of the cellularity and cellular turn over in bovine placenta.

Alterações citológicas do sangue periférico e da medula óssea de cães com cinomose / Cytological alterations of the bone marrow and peripheral blood of dogs with canine distemper

Avaliaram-se o mielograma, o hemograma e a ocorrência de apoptose no sangue periférico e na medula óssea de cães com cinomose de ocorrência natural. Foram utilizados 15 cães distribuídos em dois grupos: (a) controle - seis animais clinicamente saudáveis com RT-PCR negativa para o vírus da cinomose canina (CC); (b) infectado - nove animais com manifestações clínicas de CC e RT-PCR positiva. Dos cães com CC, oito (88,9 por cento) apresentaram anemia discreta a moderada (hematócrito: 30,6 por cento), normocítica (VCM: 67,9fL) e normocrômica (CHCM: 34,1g/dL). Todos os animais apresentaram contagens médias normais de leucócitos totais (11600 células/µL) e neutrófilos segmentados (8802 células/µL). Linfopenia foi observada em cinco animais (55,6 por cento) e desvio nuclear dos neutrófilos para a esquerda em oito (88,9 por cento). As contagens médias de linfócitos e neutrófilos bastonetes foram, respectivamente, 1054 e 1508células/µL. No mielograma, todos os animais apresentaram celularidade e relação M:E dentro dos limites de referência. O hemograma e a medula óssea dos cães-controle não apresentaram alteração e não havia células em apoptose no esfregaço sanguíneo desses animais. Nos cães com CC, a média do índice apoptótico foi 0,73 por cento no esfregaço sanguíneo e 1,87 por cento na medula óssea. A apoptose, portanto, pode estar envolvida na patogênese das alterações hematológicas observadas na CC.

The myelogram, the hemogram, and the occurrence of apoptosis in peripheral blood and bone marrow in dogs with canine distemper (CD) of natural occurrence were studied. Fifteen dogs were distributed into two groups: (a) control - six clinically healthy animals with RT-PCR negative for canine distemper virus (CDV); and (b) infected - nine animals showing clinical CD manifestations and RT-PCR positive. The majority of dogs with CD (88.9 percent) presented discrete to moderate (hematocrit: 30.6 percent), normocytic (MCH: 67.9fL) and normochromic (MCHC: 34.1g/dL) anemia. All animals showed total leukocytes counting (11,600 cells/µL) and segmented neutrophils (8,802 cells/µL) within the limits of reference. Lymphopenia and left shift neutrophils were observed in 55.6 percent and 88.9 percent of the dogs, respectively. Additionally, the average counts of lymphocytes and neutrophils were 1,054 and 1,508cells/µL, respectively. The myelogram of all animals presented cellularity and M:E relation within the limits of reference. Haemogram and bone marrow of the control dogs had no alteration. Moreover, no apoptotic cells were detected in the smear of the peripheral blood of control animals. On the other side, dogs with CD presented a higher apoptotic index (AI), both in the peripheral blood (AI: 0.73 percent) and in the bone marrow (AI: 1.87 percent). Therefore, apoptosis may contribute to hematological changes observed in CD.

Avaliação macroscópica, microscópica e histomorfométrica do tecido cicatricial pós-cirúrgico de eqüinos submetidos a duas técnicas de neurectomia digital / Macroscopic, microscopic, and histomorphometric evaluation of post-operative scar tissue in horses submitted to two techniques for digital neurectomy

Avaliou-se macro e microscopicamente o tecido cicatricial pós-operatório de eqüinos submetidos a duas técnicas de neurectomia digital: guilhotina (TG) e stripping (TS). Decorridos 14 meses das cirurgias, foram colhidas 32 amostras de tecido cicatricial em quatro éguas, que tiveram os membros submetidos a ambas as técnicas. À macroscopia, verificaram-se as dimensões da cicatriz do coto proximal e a distância entre os cotos proximal e distal. À microscopia, foi quantificada a proporção de tecido nervoso regenerado por meio de histomorfometria. Não houve diferença nas dimensões do tecido cicatricial, contudo a distância entre cotos foi 5,6 vezes maior na TS (P<0,001). Histologicamente, observou-se a presença de tecido conjuntivo frouxo e denso, macrófagos e fibras nervosas delgadas em ambas as técnicas cirúrgicas. Estruturas nodulares, compostas por fascículos nervosos, foram visualizadas em 56,2 por cento (9/16) das amostras colhidas em nervos submetidos à TS. As porcentagens médias de tecido nervoso no tecido cicatricial foram de 0,31 por cento na TG e 2,6 por cento na TS (P<0,001). Concluiu-se que o retorno à sensibilidade nervosa deve demorar mais a ocorrer após a TS, devido à maior distância entre cotos. A maior proporção de tecido nervoso sugere que essa técnica favorece a regeneração nervosa.

The post-operative healed tissues in horses submitted to two digital neurectomy techniques, the guilhotine (GT) and the stripping (ST), were evaluated by macroscopy and microscopy. Fourteen months after surgery, 32 samples of scar tissue were collected from four mares that had the members experimentally submitted to both surgical techniques. By macroscopy, the dimensions of the scar tissue of the proximal stump and the distance between nerve stumps were taken. By microscopy, the proportion of nervous tissues in the scar tissue was quantified by histomorphometry. There were no differences between the scar tissue dimensions, but the distance between stumps was 5.6-fold greater in ST subjects. Histologically, connective tissue, macrophages, and thin nervous fibers were observed in scar tissue present in animals of both groups. Nodular structures composed by nervous fascicules were visualized in 56.2 percent (9/16) of the samples collected from the ST group. The mean percentage of the nervous tissue in scar tissue was 0.31 percent in GT samples and 2.6 percent in ST samples (P<0.001). After ST, a longer time to the return of the sensibility may occur due to the greater distance between stumps. However, greater proportion of nervous tissue in the scar tissue suggests that the use of this technique favors nervous regeneration.

Apoptosis in the transplanted canine transmissible venereal tumor during growth and regression phases / Apoptose no tumor venéreo transmissível canino durante as fases de crescimento e regressão

Twelve male, mongrel, adult dogs were subcutaneously transplanted with cells originated from two canine transmissible venereal tumors (TVT). The aim was to demonstrate and to quantify the occurrence of apoptosis in the TVT regression. After six months of transplantation, a tumor sample was obtained from each dog, being six dogs with TVT in the growing phase and six in the regression phase as verified by daily measurements. Samples were processed for histological and ultrastructural purposes as well as for DNA extraction. Sections of 4µm were stained by HE, Shorr, methyl green pyronine, Van Gieson, TUNEL reaction and immunostained for P53. The Shorr stained sections went through morphometry that demonstrated an increase of the apoptotic cells per field in the regressive tumors. It was also confirmed by transmission electron microscopy, which showed cells with typical morphology of apoptosis and by the TUNEL reaction that detected in situ the 3'OH nick end labeling mainly in the regressive tumors. The regressive TVTs also showed an intensified immunostaining for P53 besides a more intense genomic DNA fragmentation detected by the agarose gel electrophoresis. In conclusion, apoptosis has an important role in the regression of the experimental TVT in a way that is P53-dependent.

Doze cães, adultos, machos e sem raça definida foram transplantados subcutaneamente, na região hipogástrica, com células originadas de dois tumores venéreos transmissíveis caninos (TVT). O objetivo do estudo foi demonstrar e quantificar a ocorrência de apoptose na regressão do TVT. Após seis meses, foi obtido um tumor de cada animal, totalizando seis em crescimento e seis em regressão. Fragmentos dos tumores foram processados para avaliação histológica, ultra-estrutural e também para extração de DNA. Cortes de 4µm foram corados em HE, Shorr, verde de metila pironina e Van Gieson e alguns foram submetidos à reação do TUNEL e à imunoistoquímica para P53. Secções coradas pelo Shorr, submetidas à morfometria, demonstram maior índice apoptótico nos tumores em regressão. Esse achado foi confirmado pela microscopia eletrônica de transmissão que evidenciou células com morfologia típica de apoptose e pela reação de TUNEL que marcou mais células nos tumores em regressão que naqueles em crescimento. A imunomarcação para P53 foi mais intensa nos tumores em regressão, assim como a fragmentação internucleossômica do genoma mostrada pela eletroforese em gel de agarose. Concluiu-se que a apoptose tem importante papel na regressão do TVT transplantado experimentalmente, sendo, nesse caso, dependente de P53 para a sua execução.

Apoptose e expressão de VP2 e GAPDH na infecção precoce pelo vírus da doença infecciosa da bursa de Fabricius em pintos SPF / Apoptosis and expression of VP2 and GADPH in an experimental infectious bursal disease in SPF chicks

Vinte e nove pintos SPF de um dia foram inoculados com o vírus da doença infecciosa da bursa de Fabricius (VDIB) para avaliar a ocorrência precoce de apoptose e a expressão da proteína viral 2 (VP2) e da enzima gliceraldeído fosfato dehidrogenase (GAPDH). Os animais foram distribuídos em cinco grupos: 1-controle; e 2 a 5- com 24, 48, 72 e 96 horas pós-inoculação, respectivamente. Fragmentos da bursa de Fabricius foram colhidos para processamento histológico e extração de RNA. Lâminas coradas em HE e TUNEL (marcação in situ da fragmentação do genoma com transferase terminal de deoxinucleotídeo) foram utilizadas na morfometria do índice apoptótico. Amostras de mRNA foram testadas para a expressão dos genes VP2 e GAPDH utilizando-se transcrição reversa e RT-PCR. Utilizou-se um kit SYBR GREEN PCR, e a reação foi desenvolvida em ABI Prism 7000 SDS. Os índices apoptóticos cresceram progressivamente indicando uma relação na atrofia bursal causada pelo VDIB. Paralelamente, os resultados da PCR em tempo real demonstraram queda da carga viral nas células linfóides da bursa nos diferentes intervalos de tempo do experimento. Esses resultados sugerem um papel protetor da apoptose na diminuição da replicação viral.

Twenty-nine SPF 1-day-old chicks were inoculated with infectious bursal disease virus (IBDV) to evaluate early apoptosis and the expression of viral protein 2 (VP2) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenease (GAPDH). Five groups were formed: G1-control -and G2 to G5, - 24, 48, 72 and 96 hours post inoculation, respectively. Half of each BF was fixed and processed by routine techniques. To quantify apoptosis, 5µm-thick sections were stained with HE and submitted to TUNEL (terminal transferase UDP nick end labeling) technique. mRNA was extracted from pooled samples of 3 animals/group and used for the expression of VP2 and GADPH genes using the reverse transcription and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). A SYBR GREEN PCR kit was used and the reaction was carried out in an ABI Prism 7000 SDS. Apoptotic indexes progressively increased indicating a role of IBDV in inducing hypotrophy of the BF. Also, it was showed that as long as apoptosis increased, viral protein expression decreased, which suggests that apoptosis plays a role as a defense mechanism against viral replication.

Efeitos da isquemia e da reperfusão na ocorrência de apoptose no jejuno em eqüinos / Effects of ischemia and reperfusion in apoptosis occurrence in equine jejunum

Investigou-se o resultado da isquemia, da congestão e da reperfusão na ocorrência de apoptose. Modelos de obstrução vascular total - artériovenosa e venosa - foram induzidos no jejuno por 2h, seguidos de reperfusão durante 12h. As amostras de tecidos foram processadas, e os dados analisados pelo teste de Friedman. As colorações de Schorr e hematoxilina-eosina evidenciaram anoiquia, condensação da cromatina, fragmentação nuclear e celular características de apoptose. índices apoptóticos significativamente mais baixos ocorreram em 2h e 12h de reperfusão na região das vilosidades, e tenderam à estabilidade na região das criptas. A apoptose constitui uma importante parcela na perda de células intestinais durante a isquemia, congestão e reperfusão, além da necrose.

The effects of ischemia and reperfusion in apoptosis occurrence in equine were studied. Intestinal samples were taken and biopsy specimens evaluated. Data were analyzed by Friedman test. Schorr and hematoxilin-eosine staining showed shrunken anoykic cells, chromatin condensation, nuclear and cellular fragmentation typical of apoptosis. Significant lower apoptotic index occurred at 2h and 12h of reperfusion in the villous region. No difference was observed in the crypt region. Apoptosis constitutes an important part of cell loss in addition to necrosis.

Morphometric analysis of the thymus of puppies infected with the Snyder Hill Strain of canine distemper virus / Análise morfométrica do timo de cães filhotes infectados com a amostra Snyder Hill do vírus de cinomose canina

The thymic morphometry analysis was used for determining apoptosis and atrophy of the thymus of eight puppies inoculated with canine distemper virus (CDV). Three healthy dogs were used as negative controls. Sections, 5æm thick, were stained by HE and Shorr, and the latter were evaluated by morphometry. CDV nucleoprotein was detected by immunohistochemistry. Morphometric results confirmed lymphoid hypotrophy in CDV inoculated dog thymuses, more stroma, less parenchyma and higher apoptotic index/field than negative control (not inoculated) puppies. Apoptosis plays a role in the mechanism of thymus atrophy that develops in canine distemper.

Determinaram-se a apoptose e a atrofia no timo de oito cães novos, inoculados experimentalmente com o vírus de cinomose. Três cães saudáveis foram usados como controle negativo. Secções coradas pelo Shorr foram avaliadas por morfometria. A nucleoproteína viral foi detectada por imunoistoquímica. Os resultados morfométricos confirmaram a hipotrofia e mostraram que o timo dos cães inoculados tinha mais estroma, menos parênquima e maior índice apoptótico/campo que o dos animais-controle. Pode-se concluir que a apoptose desempenha importante papel no mecanismo de hipotrofia tímica que se desenvolve na cinomose.

Ativação de plaquetas de eqüinos com laminite induzida e tratados com ketoprofeno, fenilbutazona e flunixin meglumina / Platelets activation in equine with induced laminitis and treated with ketoprophen, phenylbutazone and flunixin meglumin

Avaliou-se a ativação de plaquetas em 20 eqüinos com laminite induzida, tratados com ketoprofeno, fenilbutazona e flunixin meglumina. As alterações de plaquetas incluíram mudança de forma, alteração da relação entre os eixos maior e menor, aumento de perímetro, emissão de pseudópodes, aumento no número dealfa-grânulos e de grânulos de glicogênio e redução no número degama-grânulos. As plaquetas de eqüinos, quando ativadas, apresentaram perfil de organela diferente de plaquetas normais, e as drogas antiinflamatórias, não-esteroidais, demonstraram atividade na ativação plaquetária de eqüinos in vivo. O flunixin meglumina apresentou melhor atividade em modular a ativação plaquetária de eqüinos in vivo do que a fenilbutazona e o ketoprofeno.

Expressão gênica de caspases 3 e 8 em timo e baço de ratas recém-desmamadas e imunossuprimidas por glicocorticóide / Genic expression of caspases 3 and 8 in thymus and spleen of glicocorticoid-immunossupressed weaned rats

Determinou-se a expressão gênica das caspases 3 e 8 mediante transcrição reversa de mRNA total e reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) para avaliar a apoptose em timo e baço de ratas imunossuprimidas por glicocorticóides. Utilizou-se dexametasona para indução da apoptose e atrofia linfóide. Quarenta e cinco fêmeas Wistar recém-desmamadas foram separadas em três grupos: as ratas de A (n=18) e B (n=18) foram tratadas com 250 e 500mg de glicocorticóide, via intramuscular, respectivamente, e as do C (n=9) não foram tratadas. Após 24, 48 e 72 horas, seis animais de cada grupo tratado e três do controle foram anestesiados, pesados e sacrificados. O baço e o timo foram coletados e pesados. Fragmentos dos órgãos foram fixados em formol tamponado a 10 por cento e processados segundo técnica para inclusão em parafina. Os blocos foram seccionados em 5æm, e os cortes corados em hematoxilina e eosina. A análise histopatológica aliada ao peso dos órgãos nas diferentes doses e tempos demonstrou que a dexametasona induziu hipotrofia linfóide, que ocorreu com maior intensidade no tempo de 72 horas em animais do grupo B. Fragmentos de timo e de baço foram imediatamente congelados em nitrogênio líquido para extração de mRNA e DNA. Para a padronização da técnica de RT-PCR, utilizaram-se pool de amostras de mRNA dos animais-controle e pool de mRNA de animais tratados em cada tempo de experimento. A técnica de RT-PCR foi sensível o suficiente para a detecção dos mRNAs que codificam as caspases 3 e 8, e ambas participaram do processo de apoptose induzido por dexametasona.

Enxertos vasculares homólogos e heterólogos conservados em glicerina na fleboplastia da jugular em eqüinos / Arterial homograft and venous heterograft conserved in glycerin in the phleboplasty of the jugular in equines

Doze eqüinos foram divididos aleatoriamente em dois grupos de seis animais (grupos I e II), com a finalidade de estudar a compatibilidade tecidual e a propriedade de indução de trombos de dois tecidos biológicos conservados em glicerina a 98 por cento. Esses tecidos foram usados na restauração da jugular externa e se constituíram de artéria carótida comum homóloga (ACCHo), no grupo I, e veia jugular externa heteróloga (VJEHe), no grupo II. Para a restauração, utilizaram-se duas técnicas de anastomose da jugular, sendo, no grupo I, a técnica de bypass e, no grupo II, a substituição de um segmento da jugular esquerda por meio de anastomose vascular término-terminal. Para avaliar a trombogênese local e a histocompatibilidade, foram realizados exames clínicos, hematológicos, ecoDopplercardiográficos e histológicos dos segmentos vasculares enxertados. Os segmentos foram colhidos após 45 dias da avaliação pós-operatória, tendo a jugular direita como testemunha para os exames histológicos. Ambos os tecidos foram compatíveis quando implantados nos eqüinos, sem processo inflamatório acentuado, indicativo de rejeição. A técnica de bypass não foi eficiente na restauração da jugular, ocorrendo trombose obliterante dos enxertos de ACCHo. A substituição completa do segmento da jugular por VJEHe pode ser viável para o restabelecimento do fluxo sangüíneo da jugular de eqüinos, desde que se mantenha a igualdade dos diâmetros entre o enxerto e o vaso receptor.

Determination of the minimal representative number of microscopic fields to quantify apoptosis in canine lymph nodes

Determinou-se o número mínimo de campos por lâmina para se ter uma amostragem representativa para o estudo de apoptose em linfonodos de cães com cinomose. Um linfonodo traqueobrônquico de cão foi colhido e processado segundo técnica para inclusão em parafina. Secções de 5æm foram coradas pelo tricrômico de Shorr. Utilizou-se um analisador de imagens para registrar o número de células em apoptose e os índices apoptóticos de 300 campos, na mesma lâmina. Obtiveram-se, então, valores médios para 10 amostras de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 e 50 campos ao acaso. Realizou-se o estudo dos desvios-padrão das médias (DP) em relação ao tamanho da amostra que os originou. Quando as oscilações de DP entre amostras consecutivas foram menores que 5 por cento, o ganho em representatividade produzido pelo acréscimo no número de campos não se justificou, dispensando amostragens maiores. Desse modo, a análise de 40 campos por lâmina, na pesquisa de índices apoptóticos em linfonodos caninos, é suficientemente representativa, uma vez que apresenta instabilidade aceitável.

Placental maturation and expulsion in Holstein and Nelore cows

Foram avaliadas as diferenças morfológicas e a participação da apoptose na população de células do placentoma de vacas das raças Holandesa e Nelore no período periparto. Foram utilizadas 22 vacas da raça Holandesa com parto a termo (tratamento I) e 10 com parto induzido (tratamento II). Nos tratamentos III e IV foram utilizadas 10 vacas Nelore com parto a termo e 21 com parto induzido, respectivamente. As células binucleadas trofoblásticas e epiteliais carunculares e os corpos apoptóticos foram quantificadas por microscopia óptica. A apoptose também foi avaliada por microscopia eletrônica de transmissão, ELISA e determinação da fragmentação do DNA por eletroforese em gel de agarose. O número de células epitelilais carunculares não variou entre as raças com parto normal ou induzido. O número de células binucleadas diferiu entre raças com parto a termo (tratamentos I e III); contudo seu número não variou quando o parto foi induzido. Em vacas com parto a termo a intensidade da apoptose foi significativamente maior no tratamento I do que no III, pela avaliação morfométrica e por ELISA. Entretanto, não foi encontrada diferença entre os tratamentos II e IV. A característica da fragmentação de DNA para a apoptose em eletroforese foi identificada pela presença de bandas com 200 pares de bases ou múltiplos. As características da apoptose no epitélio materno e fetal e no endotélio vascular foram identificadas por microscopia eletrônica de transmissão. Os resultados permitem concluir que em vacas Nelore a maturação da placenta ocorre precocemente quando comparada à da raça Holandesa e que em ambas as raças a apoptose é um evento fisiológico ativo na maturação e eliminação da placenta.

Apoptose no placentomo de cabras gestantes intoxicadas experimentalmente com cipó-preto - Tetrapterys multiglandulosa / Apoptosis in the placentomo of pregnant goats experimentally intoxicated with cipó-preto - Tetrapterys multiglandulosa

Estudou-se a ocorrência de apoptose nos placentomos de cabras gestantes intoxicadas experimentalmente com o cipó-preto (Tetrapterys multiglandulosa A.Juss.). Analisou-se morfometricamente a intensidade do processo de apoptose nas células trofoblásticas em cabras controle (grupo III) e em animais submetidos a diferentes dosagens (grupos I e II) de cipó-preto. O grupo I foi composto por quatro cabras gestantes que receberam 10gramas/kg de peso vivo de folhas verdes da referida planta. No grupo II, quatro cabras gestantes receberam 20 gramas/kg de peso vivo de folhas verdes. A quantificação morfométrica da apoptose demonstrou que nas cabras tratadas a apoptose ocorreu com maior intensidade quando comparada com a obtida em animais do grupo-controle. Diferentes dosagens da planta (10 e 20g/kg PV) não foram um fator determinante para a maior ou menor ocorrência de apoptose, apesar de acarretar morte fetal e subseqüente aborto em momentos diferentes. A intensa apoptose em fase ainda inicial da gestação compromete funções normais da placenta, possibilitando uma explicação para a morte fetal e aborto observadas. Conclui-se que a T. multiglandulosa é tóxica para cabras gestantes nas doses de 10 e 20g/kg peso vivo ingeridas durante seis e duas semanas, respectivamente.