RESUMO
Resumo A PEGuilação, reação química de conjugação com a molécula de polietilenoglicol (PEG) ou polietilenoglicol metil éter (mPEG), tem sido amplamente aplicada pelas indústrias farmacêuticas como estratégia de melhoria das propriedades farmaco-cinéticas de compostos bioativos. O PEG é um polímero que possui um esqueleto de poliéter quimicamente inerte e que apresenta grupos hidroxilas (-OH) em suas extremidades. Assim, o PEG para tornar-se apto como reagente de conjugação deve ser ativado com um grupo funcional que seja reativo. Nesse sentido, a bromoaceti-lação apresenta-se como uma alternativa para a funcionalização do PEG. Portanto, nesse trabalho objetivamos descrever em detalhes os procedimentos e o mecanismo de reação envolvida na funcionalização do mPEG, através da reação de bromoacetilação. Além do mais, estudamos a aplicação do MALDI-ToF para a caracterização do produto ativado. Após a bromoacetilação, por um procedimento adaptado, obteve-se o bromoacetil-mPEG-éster, com rendimento bruto de 56,78%. Análises posteriores, por espectrometria de massas por MALDI-ToF, possibilitaram identificar e caracterizar o produto bromoacetilado. Entre as condições de reação, o controle de temperatura (-10 °C a 0 °C) mostrou-se eficaz favorecendo a adição nucleofílica essencial à bromoacetilação. Assim, concluímos que o controle da baixa temperatura reacional é um fator chave para o favorecimento da adição nucleofílica à carbonila e, portanto, essencial na obtenção do mPEG funcionalizado via bromoacetilação. Estudos posteriores serão necessários, no entanto, para confirmar se o mPEG esterificado, nessas condições, poderá ser utilizado na conjugação com moléculas de natureza proteica ou peptídica, por meio de substituição nucleofílica bimolecular.
SUMMARY PEGylation, a chemical reaction of conjugation with the polyethylene glycol molecule (PEG), has been widely applied by the pharmaceutical industries as a strategy to improve the pharmacokinetic properties of bioactive compounds. PEG is a polymer that has a chemically inert polyether backbone and hydroxyl groups (-OH) at its ends. Thus, PEG to become fit as a reagent for conjugation must be activated with a functional group that is reactive. In this sense, bromoacetylation presents itself as an alternative for the functionalization of PEG. Therefore, in this study we aim to describe in detail the procedures and reaction mechanism involved in the functionalization of mPEG through the bromoacetylation reaction. In addition, we used the spectrometric technique, by MALDI-ToF, for the characterization of the activated product. After applying an adapted bromoacetylation procedure, bromoacetyl-mPEG-ester was obtained with a yield of 56.78%. Subsequent analyzes of MALDI-ToF mass spectrometry were able to correctly identify and characterize the bromoacety-lated product. Among the reaction conditions, temperature control (from -10 °C to 0 °C) was effective in favoring the essential nucleophilic addition to bromoacetylation. Thus, we conclude that the control of the low reaction temperature is a key factor in favoring the nucleophilic addition to carbonyl and, therefore, obtaining a favorable conversion to functionalized PEG via bromoacetylation. Further studies, however, will be necessary to confirm whether PEG esterified with these conditions can be used in conjunction with molecules of a protein or peptide nature by means of bimolecular nucleophilic substitution.
RESUMEN La PEGilación, una reacción química de conjugación con la molécula de polietilenglicol (PEG), ha sido ampliamente aplicada por las industrias farmacéuticas como una estrategia para mejorar las propiedades farmacocinéticas de los compuestos bioactivos. El PEG es un polímero formado por un esqueleto de poliéter químicamente inerte con grupos hidroxilo (-OH) en sus extremos. Por lo tanto, para usar el PEG como reactivo de conjugación debe activarse con un grupo funcional que sea reactivo. En este sentido, la bromoacetilación es una alternativa para la funcionalización de PEG. De esta manera, en este trabajo nuestro objetivo es describir en detalle los procedimientos y el mecanismo de reacción involucrados en la funcionalización de PEG a través de la reacción de bromoacetilación. Además, estudiamos la aplicación de MALDI-ToF para la caracterización del producto activado. Después de aplicar un procedimiento de bromoacetilación adaptado, se obtuvo bromoacetil-mPEG-éster con un rendimiento bruto de 56,78%. Los análisis posteriores de espectrometría de masas por MALDI-ToF pudieron identificar y caracterizar correctamente el producto bromoacetilado. Entre las condiciones de reacción, el control de la temperatura (desde -10 °C hasta 0 °C) fue eficaz para favorecer la adición nucleofílica esencial a la bromoacetilación. Así, concluimos que el control de la baja temperatura de reacción es un factor clave para favorecer la adición nucleofílica al carbonilo y, por lo tanto, esencial para obtener el mPEG funcionalizado mediante la bromoacetilación. Sin embargo, serán necesarios más estudios para confirmar si el mPEG esterificado en estas condiciones puede usarse junto con moléculas de naturaleza proteica o peptídica por medio de la sustitución nucleófila bimolecular.
RESUMO
PnPa11 and PnPa13 are synthetic peptides derived from Phoneutria nigriventer spider venom, which display antinociceptive and neuroprotective properties. In this work, we evaluated the safety of intravitreal use and the neuroprotective effect of these peptides. Methods: The cytotoxicity and the antiangiogenic activity of these peptides were evaluated by the sulforhodamine-B method and chicken chorioallantoic membrane (CAM) assay, respectively. The in vivo safety was analyzed in Wistar rats that were intravitreally injected with different doses (0.50; 1.25; 2.50; 3.75 and 5.00 µg/mL) of these peptides (right eye, n = 6). The retinal function was assessed by electroretinography exams (ERG), intraocular pressure (IOP), and histological analyzes. In order to investigate the neuroprotective effect, Wistar rats received intravitreal injections (right eye, n = 6) of peptides at 1.25 µg/mL and then were exposed to blue LED light. In addition, the visual function and the retinal microstructure were verified. Results: Cytotoxicity analyses demonstrated that the peptides did not present any toxicity over ARPE-19 (adult retinal pigmented epithelial) cell line and the antiangiogenic study highlighted that the peptides promoted the reduction of blood vessels. The intravitreal injection did not cause major changes, neither induced any irreversible damage. In the retinal degeneration assay, the ERG records demonstrated that the prior treatment with PnPa11 and PnPa13 protected the retina from damage. Morphological analyses confirmed the ERG findings. Immunoblotting analyses revealed that PnPa11 increased Erk1/2, NR2A, and NR2B retinal expression after the light stress model, but did not cause Akt1 activation, while PnPa13 prevented Erk1/2 and Akt1 dephosphorylation. Conclusions: The intraocular administration of these peptides was well tolerated and presented protective activity against retinal degeneration, suggesting the potential use of these peptides as neuroprotectors in the ophthalmological field.(AU)