Evaluación de la metilación del DNA en tejidos de cáncer colorrectal fijados en formalina y embebidos en parafina (FFPE) / Evaluation of DNA methylation in formalin-fixed, paraffin embedded colorectal cancer tissues (FFPE)

Resumen Las alteraciones en la metilación de dinucleótidos CpG en regiones promotoras es uno de los mecanismos epigenéticos implicados en cáncer que tiene uso potencial como biomarcador. Su evaluación, a partir de tejidos fijados en formalina y embebidos en parafina (FFPE), representa un gran desafío dadas la degradación parcial, el entrecruzamiento y las bajas cantidades del DNA obtenido. En esta nota técnica, describimos un protocolo para el estudio del estado de metilación del promotor distal del proto-oncogén K-RAS, a partir de varias muestras obtenidas de dos tejidos FFPE de cáncer colorrectal con antigüedad de 11 años. Se empleó un protocolo de conversión con bisulfito alternativo al usual; se usó una DNA polimerasa modificada y una PCR anidada y se optimizó la secuenciación directa del DNA convertido con bisulfito. Este protocolo podría ser aplicado para determinar estados de metilación en otros genes y tipos de cáncer en tejidos FFPE.

Abstract Alterations in the methylation of CpG dinucleotides in promoter regions is one of the epigenetic mechanisms involved in cancer that has potential use as a biomarker. Its evaluation from formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissues represents a great challenge given the partial degradation, crosslinking, and low amounts of the obtained DNA. In this technical note we describe a protocol for the study of the methylation status of the distal promoter of the K-RAS proto-oncogene from several samples obtained from two 11-years old FFPE tissues of colorectal cancer. An alternative bisulfite conversion protocol to the usual one was used; a modified DNA polymerase and a nested PCR were used and the direct sequencing of the converted DNA with bisulfite was optimized. This protocol could be applied to determine methylation states in other genes and types of cancer.

Comparación de métodos de extracción de ADN en tejidos parafinados y utilidad para amplificación por PCR / Comparison of DNA extraction methods from formalin-fixed paraffin sections for RCP amplification

Los tejidos fijados en formol e incluidos en parafina son una fuente de material para hallazgos moleculares en el ámbito clínico y científico, demostrándose que el ADN extraído de éstos, es adecuado para amplificación a través de la reacción en cadena de la polimerasa (RCP). En este estudio, se ensayaron tres métodos de extracción de ADN en tejidos incluidos en parafina, con el objetivo de comparar la eficiencia de estos para obtener ADN adecuado, además se analizó su utilidad en amplificación por RCP. Se emplearon tres muestras, correspondientes a una biopsia de pulmón, legrado endometrial y ganglio linfático, todas fijadas en formaldehido al 10% e incluidas en parafina. Utilizándose tres métodos diferentes de extracción de ADN (extracción por salting out, método modificado de Sambrook y kit comercial) El ADN obtenido se cuantificó por espectrofotometría, además se realizó electroforesis en gel de agarosa al 1%, para comprobar si el ADN era de buena calidad y se realizó RCP para el exón 3 del gen caveolina 1. Todos los métodos dieron como resultado una buen producto de ADN genómico, observándose mayor cantidad y pureza en los métodos de salting out y kit comercial, asimismo se obtuvo amplificación del producto esperado por estos dos métodos, no hubo buenos resultados con el ADN extraído por el método modificado "Preparation of Genomic DNA from Mouse Tails y Other Small samples, según Sambrook". El ADN obtenido a partir de tejidos FFIP puede ser amplificado por varios métodos, entre estos, la extracción por salting out es útil y con poca toxicidad, permite obtener ADN de buena calidad para amplificación por RCP.

Formalin-fixed and paraffin-embedded tissues are a source of important molecular findings in clinical and scientific, demonstrating that the DNA extracted from these is suitable for amplification by polymerase chain reaction (PCR). In this study, we tested three methods of DNA extraction, in order to compare the efficiency of these DNA for RCP amplification. Three samples were used, corresponding to a lung biopsy, endometrial curettage and lymph node, all fixed in 10% formaldehyde and embedded in paraffin. Three different methods were used for DNA extraction (extraction by salting out, modified Sambrook method and commercial kit) The DNA obtained was analyzed by spectrophotometry, and gel electrophoresis was performed in 1% agarose to check if the DNA was amplifiable. PCR was performed for exon 3 of caveolin-1 gene. All methods resulted in a good product of genomic DNA, obtaining more quality and purity in the salting out and commercial kit methods. Also, we obtained amplification of the product by these two methods, without favorable results with the DNA extracted by the modified "Preparation of Genomic DNA from Mouse Tails and Other Small samples, according to Sambrook et al." The DNA obtained from FFPE can be amplified by several methods, among them, salting out extraction is an easy, effective and low toxicity for obtaining good quality DNA for PCR amplification.