RESUMO
Abstract The rocketing number of COVID-19 cases highlighted the critical role that diagnostic tests play in medical and public health decision-making to contain and mitigate the SARS-CoV-2 pandemic. This study reports the evaluation and implementation of different tests for the molecular detection of SARS-CoV-2 in the central region of Argentina. We evaluated 3 real time RT-PCR kits (GeneFinder COVID-19 Plus RealAmp Kit, DisCoVery SARS-CoV-2 RT-PCR Detection Kit and WGene SARS-CoV-2 RT Detection), 2 nucleic acid extraction methods [MagaBio plus Virus DNA/RNA Purification Kit II (BioFlux), 35-min vs. 9-min, a pre-analytical reagent (FlashPrep®) and 2 isothermal amplification tests (Neokit Plus and ELA CHEMSTRIP®). The order according to the best performance of the 3 real-time RT-PCR kits evaluated was: DisCoVery > GeneFinderTM> WGene. The 2 RNA extraction methods showed similar good results: MagaBio plus Virus RNA Purification Kit II (BioFlux) 9-min was selected due to its faster performance. FlashPrep® reagent showed excellent results to perform direct RNA detection. Isothermal amplification assays showed acceptable sensitivity and specificity values (>80%), except in samples with Ct> 30. Our data show optimal real time RT-PCR kits and alternative molecular methods for SARS-CoV-2 diagnostic. These alternative assays proved to be aceptable.
Resumen La explosión de casos de COVID-19 resaltó el papel fundamental que desempeñan las pruebas de diagnóstico en la toma de decisiones médicas y de salud pública para contener y mitigar la pandemia de SARS-CoV-2. Este estudio reporta la evaluación y la implementación de diferentes test para la detección molecular de SARS-CoV-2 en la región central de Argentina. Evaluamos tres kits de RT-PCR en tiempo real (GeneFinder COVID-19 Plus RealAmp Kit, DisCoVery SARS-CoV-2 RT-PCR Detection Kit y WGene SARS-CoV-2 RT Detection), dos métodos de extracción de ácidos nucleicos (MagaBio plus Virus DNA/RNA Purification Kit II [BioFlux, 35-min vs. 9-min), un reactivo pre-analítico (FlashPrep®) y dos test de amplificación isotérmica (Neokit Plus and ELA CHEMSTRIP®). El orden de rendimiento de los tres kits de RT-PCR en tiempo real evaluados fue el siguiente: DisCoVery GeneFinder™ WGene. Los dos métodos de extracción de RNA mostraron buenos y similares resultados; se seleccionó MagaBio plus Virus RNA Purification Kit II (BioFlux) 9-min debido a su rápido tiempo de procesamiento. El reactivo FlashPrep® mostró excelentes resultados para realizar detección directa de RNA. Los ensayos de amplificación isotérmica mostraron valores de sensibilidad y de especificidad aceptables (80%), excepto en muestras con Ct 30. Nuestros resultados muestran kits de RT-PCR en tiempo real óptimos, como así también métodos moleculares alternativos para el diagnóstico de SARS-CoV-2 que resultan aceptables para su uso en contextos adversos, de descentralización y en diferentes escenarios epidemiológicos, para la detección rápida y precisa del SARS-CoV-2.
RESUMO
Abstract Introduction: Most successful cases of COVID-19 pandemic mitigation and handling have relied on extensive reverse-transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). However, many emerging economies have struggled with current molecular testing demands due to economic, technical and technological constraints. Objective: To define a potential diagnostic protocol to increase testing capacity in current and post-pandemic conditions. Methods: We reviewed the literature, patents and commercial applications, for alternatives. Results: We found a good potential in saliva samples, viral inactivation and quick RNA extraction by heating; the use of an isothermal technology such as loop mediated isothermal amplification (LAMP) and naked eye test-result visualization by in-tube colorimetry or turbidity. Conclusions: Saliva samples with quick RNA extraction by heating and colorimetric LAMP are promising options for countries with economic and infrastructure limitations.
Resumen Introducción: La mayoría de los casos exitosos de mitigación y manejo de la pandemia de COVID-19 se han dado mediante pruebas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (RT-qPCR por sus siglas en inglés). Sin embargo, muchas economías emergentes han tenido problemas con las demandas actuales de pruebas moleculares debido a limitaciones económicas, técnicas y tecnológicas. Objetivo: Definir un protocolo de diagnóstico potencial para aumentar la capacidad de prueba en las condiciones actuales y posteriores a la pandemia. Métodos: Revisamos la literatura, las patentes y las aplicaciones comerciales, en busca de alternativas. Resultados: Encontramos un buen potencial en muestras de saliva, inactivación viral y extracción rápida de ARN por calentamiento; el uso de una tecnología isotérmica como la amplificación isotérmica mediada por horquillas (LAMP, por sus siglas en inglés) y la visualización del resultado de la prueba a simple vista mediante colorimetría o turbidez en el tubo. Conclusiones: Las muestras de saliva con extracción rápida de ARN por calentamiento y LAMP colorimétrico son opciones prometedoras para países con limitaciones económicas y de infraestructura.
Assuntos
Humanos , Técnicas de Diagnóstico Molecular/métodos , Teste Sorológico para COVID-19 , COVID-19RESUMO
Recientemente se introdujo en el diagnóstico de malaria una técnica llamada amplificación isotérmica de ácidos nucleicos, que usa el material genético plasmodial. Este escrito revisa la información disponible sobre amplificación isotérmica de ácidos nucleicos, especialmente en el campo del paludismo. Metodología: se revisaron las bases electrónicas Lilacs, Scielo, PubMed (Medline) y Ovid. Resultados: solo se encontraron tres referencias sobre amplificación isotérmica de ácidos nucleicos y malaria pero hubo abundante información sobre amplificación isotérmica de ácidos nucleicos en otras infecciones y campos de la medicina, en especial la infectología. La reacción de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos requiere de una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena y cuatro cebadores especialmente diseñados para reconocer seis secuencias distintas. Esto garantiza alta especificidad para la amplificación. Varias alternativas de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos se han desarrollado para la identificación de virus, bacterias, micoplasmas, protozoos, hongos y levaduras. Ventajas de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos son capacidad de amplificar ácidos nucleicos bajo condiciones isotérmicas (60-65 ºC); posibilidad de lectura y semicuantificación a simple vista y de cuantificación con un turbidímetro; altas sensibilidad y especificidad y, en general, capacidad diagnóstica; rapidez, bajo costo y facilidad de aplicación; tolera los componentes de los medios de cultivo y las sustancias biológicas. Entre las desventajas están que la baja concentración de ADN molde disminuye la eficacia del reconocimiento de los cebadores; la observación de la turbidez fue menos sensible que la visualización de los productos en gel de agarosa teñidos con bromuro de etidio y es crítica la prevención de la contaminación...
Introduction: isothermal nucleic acid amplification (LAMP) was recently reported in the diagnosis of malaria. This uses plasmodial DNA to confi rm the diagnosis. This paper reviews the most relevant available information on LAMP, especially in the field of malaria. Methodology: the electronic databases Lilacs, Scielo, PubMed (Medline) and Ovid, were reviewed. Results: only three references were found on LAMP and malaria but there was abundant information on LAMP and other infections in fields of medicine, mainly in infectious diseases. The LAMP reaction requires a strand displacement DNA polymerase and a system of four primers specifically designed to recognize a total of six different sequences in the DNA target. This guarantees high specificity. Several alternatives of LAMP have been developed to identify viruses, bacteria, mycoplasma, protozoa, fungi and yeast. Advantages of LAMP: ability to amplify nucleic acids under isothermal conditions (60 and 65 ºC9; possibility of semi-quantitative reading by observation and quantitative interpretation using a turbidimeter; high sensitivity and specificity and, in general, diagnostic capacity, speed, low cost and ease of implementation; better performance than PCR when culture media and biological substances are processed. Disadvantages: the low concentration of DNA template reduces the primers effi cacy recognition; turbidimetry was less sensitive than the agarose gel and ethidium bromide analysis, prevention of contamination is critical...