Isolation, identification and technological properties of lactic acid bacteria from raw cow milk / Isolamento, identificação e propriedades tecnológicas de bactérias ácido lácticas a partir de leite de vaca cru

Lactic acid bacteria are used as starter culture for the production of fermented dairy products, and that occur naturally as indigenous microbiota of the raw milk. In this study, lactic acid bacteria were isolated from raw cow milk samples. The serial dilutions of raw milk were made and plated onto LM17 agar and MRS agar adjusted to pH 5.4. The isolates were firstly identified based on cell morphology, reaction to gram stain, catalase production, growth in MRS broth containing 2%, 4%, and 6.5% NaCl, growth ability of different temperatures and formation of gas in MRS broth. Acid formation in 10% reconstituted skim milk and antimicrobial activity against foodborne pathogens Listeria monocytogenes ATCC 7644, Stapylococcus aureus ATCC 25923, and Clostridium perfringens ATCC 13124 were examined using agar well diffusion method. The total of 90 LAB isolates were classified as Lactobacillus (37.78%), Lactococcus (36.67%), Enterococcus (20.00%), Streptococcus (4.44%), and Leuconostoc (1.11%). Based on technological properties, 56 of 90 isolates (42 cocci, 14 rods) were selected, and further identified at the species level using API 20 Strep and API 50 CH identification system, respectively. The Lactobacillus isolates were identified as Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus paracasei ssp. paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, and Lactobacillus rhamnosus. The enzymatic profiles of the 17 selected isolates were studied with API ZYM system. The Lactobacillus spp. strains tested displayed high leucine arylamidase activity. Two Lactococcus lactis ssp. lactis AKS320.1 and AKS320.2 strains and one Enterococcus faecalis AKS424 strain were able to produce bacteriocin. In conclusion, some of these isolates could be considered as potential starter culture candidates for fermented milk products.

Bactérias de ácido lático são utilizadas como cultura inicial para a produção de produtos lácteos fermentados e que ocorrem naturalmente como microbiota indígena do leite cru. Neste estudo, as bactérias ácido lácticas foram isoladas a partir de amostras de leite cru de vaca. As diluições em série do leite cru foram feitos e plaqueadas em ágar LM17 e agar MRS ajustado para pH 5,4. Os isolados foram primeiramente identificados com base na morfologia das células, coloração pelo Método de Gram, produção de catalase, crescimento em caldo MRS contendo 2%, 4%, e 6,5% de NaCl, a capacidade de crescimento de diferentes temperaturas e formação de gás em caldo MRS. Foram avaliadas a formação de ácido em 10% de leite desnatado reconstituído e propriedades antagonistas contra os agentes patogênicos de origem alimentar Listeria monocytogenes ATCC 7644, Stapylococcus aureus ATCC 25923, e Clostridium perfringens ATCC 13124, usando o método de difusão em agar. O total de 90 isolados de laboratório foram classificados como Lactobacillus (37,78%), de Lactococcus (36,67%), Enterococcus (20,00%), Streptococcus (4,44%), e Leuconostoc (1,11%). Com base em propriedades tecnológicas, foram selecionados 56 dos 90 isolados (42 cocos, 14 hastes) e identificados ao nível das espécies usando o sistema de identificação API 20 Strep e API 50 CH, respectivamente. Os isolados de Lactobacillus foram identificados como Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus paracasei ssp. paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis e Lactobacillus rhamnosus. Os perfis enzimáticos dos 17 isolados selecionados foram estudados por meio do sistema API ZYM. As cepas de Lactobacillus possuem alta atividade de arilamidase leucina. Duas cepas de Lactococcus lactis ssp. lactis AKS320,1 e AKS320,2 cepas e um Enterococcus faecalis AKS424 estirpe foram capazes de produzir bacteriocina. Em conclusão, alguns destes isolados poderiam ser considerados como potenciais candidatos de cultura iniciadora para produtos à base de leite fermentados.

Optimization of the yield of bacteriocin-like substance (BLIS) produced by Pediococcus pentosaceus and its application as food bioconservative / Otimização do rendimento de substância semelhante a bacteriocina (BLIS) produzido por Pediococcus pentosaceus e sua aplicação como bioconservante de alimentos

Bacteriocins are peptides produced by various species of bacteria, especially lactic acid bacteria (LABs), which exhibit a large spectrum of action against spoilage bacteria and foodborne pathogens. However, when this bacteriocin has not been completely characterized regarding its amino acid and the nucleotide sequences of the corresponding gene, the qualified term bacteriocin-like inhibitory substance (BLIS) is recommended. In order to increase the antimicrobial activity of bacteriocins, the ability of probiotics LABs, such as Pediococcus pentosaceus, to ferment different carbon and nitrogen sources has been studied. For the development of an improved culture medium, carbon and nitrogen sources must be considered as nutrients responsible for cell growth and bacteriocin production. The best condition, after 48 h of cultivation, for growth (3.420 g/L) and for BLIS production by Pediococcus pentosaceus ATCC 43200 was in Man, Rogosa and Sharp (MRS) culture medium supplemented with 1.5% peptone, initial pH 6.0 and under the following culture conditions: anaerobiosis, 30oC and agitation of 200 rpm. Compared with control (MRS without supplement), the growth of Pediococcus was significantly lower (1.995 g/L) as well as it reduced significantly its generation time from 2.05 h (control) to 1.28 h (MRS supplemented), a reduction of approximately 62.5%. Moreover, addiction of peptone to MRS medium promoted reduction of 4 h to the Pediococcus exponential phase onset. Regarding BLIS antimicrobial activity, addition of nitrogen source to MRS medium was also quite significant. Through the agar diffusion method, BLIS showed inhibition halos between 12.50 and 19.50 mm against LABs strains (Lactobacillus sakei ATCC 15521, Lactobacillus plantarum CECT 221 and Carnobacterium piscicola CECT 4020). Against Listeria strains (Listeria innocua NCTC 111288 and Listeria seeligeri NCTC 11289), their antimicrobial activity was better detected in liquid medium assay, evaluating the minimal inhibitory concentration of 50%. BLIS was able to inhibit 60 and 100% of L. seeligeri and L. innocua, respectively, as well as, diluted 1x (v/v) in water was able to inhibit 100% growth of both Listeria. BLIS 17 showed also good results as food preservative when applied in ready-to-eat pork ham artificially contaminated with L. seeligeri in vacuum-package at 4oC during shelf life of 10 days. BLIS was able to maintain low Listeria multiplication, lower samples weight loss, low lipid peroxidation and good color parameters during samples storage. Results demonstrated the importance of optimizing the culture medium to increase microbial mass, to produce and to improve the activity of this antimicrobial molecule. Moreover, results also suggest the possible application of BLIS as a natural food preservative

Bacteriocinas são peptídeos produzidos por várias espécies de bactérias, especialmente bactérias ácido-láticas (BALs) e apresentam um amplo espectro de ação contra bactérias deteriorantes e patógenos de origem alimentar. Entretanto, quando estas bacteriocinas não foram completamente caracterizadas quanto a sequência de seus nucleotídeos e do seu gene correspondente, é recomendada a denominação de substância semelhante a bacteriocina (BLIS). Para aumentar a atividade antimicrobiana de bacteriocinas, a habilidade de BALs probióticas, como Pediococcus pentosaceus, em fermentar diferentes fontes de carbono e nitrogênio tem sido estudado. Para o desenvolvimento de um meio de cultura melhorado, fontes de carbono e nitrogênio devem ser consideradas como nutrientes responsáveis pelo crescimento celular e pela produção de bacteriocina. A melhor condição, após 48 h de cultivo, para o crescimento (3,420 g/L) e para a produção de BLIS por P. pentosaceus ATCC 43200 foi em meio de cultivo Man, Rogosa e Sharp (MRS) suplementado com 1,5% de peptona, pH inicial 6,0 e sob as seguintes condições de cultivo: anaerobiose, 30oC e agitação de 200 rpm. Comparado ao controle (MRS sem suplementação), o crescimento de Pediococcus foi significativamente menor (1,995 g/L) assim, como também, reduziu significativamente o tempo de geração de 2,05 h (controle) para 1,28 h (MRS suplementado), uma redução de aproximadamente 62,5%. Além disso, a adição de peptona ao meio MRS promoveu redução de 4 h para o início da fase exponencial de Pediococcus. Quanto a atividade antimicrobiana de BLIS, a adição de fonte de nitrogênio ao meio MRS também foi bastante significativa. Através do método ágar difusão, BLIS apresentou halos de inibição entre 12,50 a 19,50 mm contra cepas de BALs (Lactobacillus sakei ATCC 15521, Lactobacillus plantarum CECT 221 e Carnobacterium piscicola CECT 4020). Contra cepas de Listeria (Listeria innocua NCTC 11288 e Listeria seeligeri NCTC 11289), a sua atividade inibitória foi melhor detectada em meio líquido, através da determinação da concentração mínima inibitória de 50%. BLIS sem diluição foi capaz de inibir 60 e 100% de L. seeligeri e L. innocua, 15 respectivamente, assim como, diluído 1x (v/v) em água foi capaz de inibir 100% o crescimento de ambas Listeria. BLIS também apresentou bons resultados como conservante de alimento quando aplicado em presunto contaminado artificialmente com L. seeligeri e armazenado a 4oC a vácuo por 10 dias. BLIS foi capaz de manter baixa a multiplicação de Listeria, menor perda de peso das amostras, baixa peroxidação lipídica e bons parâmetros de cor durante o armazenamento das amostras. Os resultados demonstraram a importância de se otimizar meio de cultivo tanto para o aumento da massa microbiana como para a produção e melhoramento da atividade desta molécula antimicrobiana. Além disso, os resultados também sugerem a possível aplicação de BLIS como conservante natural de alimentos

Cellular response of the bovine mammary gland after Weissella confusa infusion to control Streptococcus agalactiae / Resposta celular da glândula mamaria bovina após infusão com Weissella confusa para o controle de Streptococcus agalactiae / Respuesta celular de la glándula mamaria bovina después de la infusión con Weissella confusa para el control de Streptococcus agalactiae

Background: the use of lactic acid bacteria (LAB) as a potential therapeutic agent to control bovine mastitis was previously proposed. However, little is known about the cellular response of the bovine mammary gland in cattle infected with Streptococcus agalactiae and treated with LAB. Objective: to assess the cellular response by the mammary gland in lactating cows after infection with Streptococcus agalactiae followed by infusion with Weissella confusa as antibacterial treatment. Methods: healthy udder quarters of lactating cows were infected with S. agalactiae (10(7) cfu/mL). After 24 h of pathogen infusion, 50% of the quarters were infused with 109 cfu/mL of W. confusa (SW) and the remaining 50% were kept as control units (S). At days 1, 2, 3, 4, 5, 11, and 14 post-infusion of the pathogen, the clinical signs of mastitis and the degree of cellular response by the mammary gland were evaluated using the California mastitis test, somatic cell count, electrical conductivity, and differential leukocyte count in milk. Results: the SW quarters showed clinical inflammation of the mammary gland associated with a significant increase in somatic cell count, California mastitis test, electrical conductivity and high proportion of polymorphonuclear neutrophils. The results suggest that the infusion with W. confusa cells induced a higher cellular immune response in the bovine mammary gland than S. agalactiae alone. Conclusions: results indicate that W. confusa infusions for controlling S. agalactiae should not be adopted. However, the activation mechanism of somatic cells in the mammary gland needs to be elucidated.

Antecedentes: previamente se propuso el uso de bacterias ácido lácticas (LAB) como agentes terapéuticos potenciales para el control de mastitis bovina. Sin embargo, poco se ha investigado sobre la respuesta celular de la glándula mamaria bovina ante la aplicación de LAB en bovinos infectados con Streptococcus agalactiae. Objetivo: evaluar, en vacas lactantes, la respuesta celular de la glándula mamaria después de la infección con Streptococcus agalactiae y la infusión intrapezón con Weissella confusa como tratamiento. Métodos: cuartos sanos de ganado criollo Hartón del Valle en estado de lactancia, se infectaron con S. agalactiae (10(7)ufc/ mL). Transcurridas 24 horas post-infusión del patógeno, al 50% de los cuartos se les aplicó W. confusa a concentración de 10(9) ufc/mL (cuartos SW) y el 50% de los cuartos restantes se tomaron como unidades experimentales control (cuartos S). En los días 1, 2, 3, 4, 5, 11 y 14 pos-infusión del patógeno, se evaluaron signos clínicos de mastitis y el grado de respuesta celular de la glándula mamaria, a través de california mastitis test, recuento de células somáticas, conductividad eléctrica y diferencial de leucocitos en leche. Resultados: en los cuartos SW se observaron evidencias clínicas de inflamación de la glándula mamaria asociada con incremento significativo de recuento de células somáticas, California mastitis test, conductividad eléctrica, y altos porcentajes de neutrófilos polimorfonucleares. Los resultados sugieren que la infusión con células de W. confusa genera mayor respuesta celular en la glándula mamaria bovina que S. agalactiae. Conclusiones: los resultados indican que no puede utilizarse la infusión de células vivas de W. confusa como tratamiento para el control de S. agalactiae. Se debe investigar otro mecanismo de uso de la LAB para el tratamiento de mastitis bovina.

Antecedentes: previamente foi proposto o uso de bactérias ácido-lácticas (LAB), como agentes terapêuticos potenciais para o controle da mastite bovina. No entanto, pouca pesquisa tem sido feita sobre a resposta celular da glândula mamária de bovinos após aplicação de LAB em bovinos infectados com Streptococcus agalactiae. Objetivo: avaliar, em vacas em período de lactação, a resposta celular da glândula mamária após a infecção com Streptococcus agalactiae e a infusão dentro da teta de Weissella confusa como tratamento. Métodos: tetas saudáveis de gado nativo Harton del Valle em lactação foram infectados com S. agalactiae (10(7)ufc/mL). Ventiquatro horas após a infusão do agente patogénico, a 50% dos quartos foi administrada W. confusa em concentração de 10(9) ufc/mL (quartos SW) e 50% dos quartos foram usados como unidades experimentais de controle (quartos S). Nos dias 1, 2, 3, 4, 5, 11 e 14 após a infusão do agente patogénico, foram avaliados os sinais clínicos de mastite e o grau de resposta celular da glândula mamária através do Califórnia Mastite Teste, contagem de células somáticas, condutividade elétrica e diferencial de leucócitos do leite. Resultados: nos quartos SW observou-se evidência clínica de inflamação da glândula mamária associado ao aumento significativo na contagem de células somáticas, Califórnia mastite teste, condutividade eléctrica, e altas porcentagens de neutrófilos polimorfonucleares. Os resultados sugerem que a infusão de células de W. confusa gera maior resposta celular na glândula mamária bovina que o S. agalactiae. Conclusões: os resultados indicam que a infusão de células vivas de W. confusa como um tratamento para o controle de S. agalactiae não pode ser usado. Outros métodos de uso da LAB para o tratamento de mastite devem ser pesquisados.