Bioautography to assess antibacterial activity of Ottonia martiana Miq. (Piperaceae) on the human oral microbiota

Ottonia martiana Miq. (Piperaceae), planta conhecida popularmente por "anestésia" e empregada no tratamento de odontalgias devido à sua ação anestésica sobre a mucosa oral, foi investigada por meio de ensaios antibacterianos de difusão em disco de papel e de bioautografia frente a microorganismos presentes na microbiota oral humana [Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus mitis (ATCC 49456), Streptococcus pyogenes (ATCC 19615), Streptococcus salivarius (ATCC 25975), Escherichia coli (ATCC 11229 e 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Enterobacter aerogenes (ATCC 27853). Os resultados dos bioensaios mostraram que o extrato bruto de O. martiana (32.9 mg mL-1) apresenta potencial antibacteriano frente às bactérias Gram-positivas testadas. Dentre as substâncias bioativas detectadas foram identificadas a piperovatina (Rf 0.35), piperlonguminina (Rf 0.52) e a isopiperlonguminina (Rf 0.52). A piperovatina e isopiperlonguminina foram isoladadas do extrato das raízes de O. martiana, guiadas pelo teste de bioautografia.

Ottonia martiana Miq. (Piperaceae), a plant known popularly in southern Brazil as "anestésia" and used in the treatment of odontalgia for its anesthetic action on the oral mucosa, was investigated for antibacterial activity by paper disc agar diffusion and bioautographic methods, against microorganisms present in the human oral cavity [Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus mitis (ATCC 49456), Streptococcus pyogenes (ATCC 19615), Streptococcus salivarius (ATCC 25975), Escherichia coli (ATCC 11229 and 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) and Enterobacter aerogenes (ATCC 27853).The crude extract of O. martiana (32.9 mg mL-1) had antibacterial potential against all Gram-positive bacteria tested. Analysis of the bioautograms led to the detection of bioactive substances, among which it was possible to identify piperovatine (Rf 0.35), piperlonguminine (Rf 0.52) and isopiperlonguminine (Rf 0.52). The piperovatine and isopiperlonguminine were isolated from the roots of O. martiana, guided by a bioautographic antibacterial bioassay.

Flavonoids of Lonchocarpus montanus A.M.G. Azevedo and biological activity

The analysis of root extracts from Lonchocarpus montanus A.M.G. Azevedo resulted in the isolation of twenty three compounds chiefly flavonoids of which five (four flavonoids and one benzophenone) are described for the first time. The molecular structures of the new compounds (1-5) were determined through spectral analysis (UV, IR, MS and NMR) as being: 2'-hydroxy-8-(a,a-dimethylallyl)-2", 2"-dimethylpyrano-(5",6":3',4')-dibenzoylmethane (1), 2'-methoxy-8-(a, a-dimethylallyl)-2", 2"-dimethylpyrano-(5",6":3',4')-dibenzoylmethane (2), 4'-methoxy-2",2"-dimethylpyrano-(5",6":8,7)-flavone (3), 2"-(1-hydroxy-1-methylethyl)-furano-(4",5":8,7)-flavone (4) and [2'-methoxy-furano-(4",5":3',4')-phenyl]-phenylmethanone (5). Additionally, fifteen fatty acids were detected through GC-MS analysis of the corresponding methyl esters [(CH3)2CH(CH2)8COOH and CH3(CH2)nCOOH (n = 6, 12-24)]. Quantitative RP-HPLC showed that the most abundant flavonoids in the petroleum ether and dichloromethane extracts were pongamol (19 percent) and lanceolatine B (8.0 percent), respectively. In the bioautography assay, the extracts, pongamol (9), lanceolatine B (10), isolonchocarpin (14), derriobtusone A (17) and medicarpine (18) were active against Staphilococus aureus whereas 9 also against Bacillus subtilis and Cladosporium cladosporioides. Compound 1, 2",2"-dimethylpyrano-(5",6":8,7)-flavone (11) and furano-(1200,1300:7,8)- 4'-methoxy flavone (12) were active against Fusarium oxysporium whereas 11 also against Rhizopus orizae. The extracts, compounds 9, 10, 17 and (E)-7-O-methoxypongamol (23) displayed high toxicity in the brine shrimp lethality assay.

A análise dos extratos das raízes de L. montanus A.M.G. Azevedo resultou no isolamento de vinte e três compostos principalmente flavonóides dos quais cinco são descritos pela primeira vez. As estruturas moleculares dos novos compostos (1-5) foram propostas através da análise dos espectros de UV, IV, EM e RMN como sendo: 2'-hidroxi-8-(a, a-dimetilalil)-2", 2"-dimetilpirano-(5", 6":3',4')-dibenzoilmetano (1), 2'-metoxi-8-(a,a-dimetilalil)-2", 2"-dimetilpirano-(5", 6":3',4')-dibenzoilmetano (2), 4'-metoxi-2", 2"-dimetilpirano-(5", 6":8,7)-flavona (3), 2"-(1-hidroxi-1-metiletil)-furano-(4", 5":8,7)-flavona (4) e [2'-metoxi-furano(4", 5":3',4')-fenil]-fenilmetanona (5). Adicionalmente quinze ácidos graxos foram detectados através da análise de CG-EM dos ésteres metílicos correspondentes [(CH3)2CH(CH2)8COOH e CH3(CH2)nCOOH (n = 6, 12-24)]. A análise quantitativa por CLAE mostrou que os flavonóides mais abundantes nos extratos éter de petróleo e diclorometânico foram pongamol (19 por cento) e lanceolatina B (8.0 por cento), respectivamente. Nos ensaios de bioautografia, os extratos, pongamol (9), laceolatina B (10), isolonchocarpina (14), derriobtusona A (17) e medicarpina (18) foram ativos contra Staphilococcus aureus enquanto 9, também contra Bacillus subtilis e Cladosporium cladosporióides. O composto 1, 2", 2"-dimetilpirano-(5", 6":8,7)-flavona (11) e furano-(2", 3":7,8)-4'-metoxiflavona (12) foram ativos contra Fusarium oxysporium, enquanto 11, também contra Rhizopus oryzae. Os extratos assim como os compostos 9, 10, 17 e (E)-7-O-metoxipongamol (23) apresentaram alta toxicidade no ensaio de letalidade com Artemia salina.

Analysis of the composition of Brazilian propolis extracts by chromatography and evaluation of their in vitro activity against gram-positive bacteria

Brazilian propolis from São Paulo state was submitted to extraction using several solvents, resulting in extracts with different composition. These extracts were submitted to Thin Layer Chromatography (TLC). Bioauthographic analysis of the TLC plates identified fractions with inhibitory activity, which were then analysed by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). In vitro assays, commonly used to evaluate the activity of propolis against Gram-positive bacteria, were compared to determine which rendered the most consistent results. The bactericidal activity of these extracts were analysed by Serial Dilution in Tubes and Agar Plate Diffusion. Serial Dilution in Tubes obtained the most consistent results, with the Minimal Bactericidal Concentration of the extracts ranging between 2.5 and 20.0 mg/mL, for the species of Gram-positive bacteria tested. The results of the Agar Plate Diffusion were directly proportional to the hydro-solubility of the extracts and did not evaluate their bactericidal activity correctly. The bactericidal activity of this sample of propolis was due to the combined effect of several components that were identified by HPLC and were best extracted using 50% ethanol as a solvent.

Própolis brasileira, proveniente do estado de São Paulo, foi submetida à extração usando vários solventes, resultando em extratos com diferentes composições. Estes extratos foram submetidos à Cromatografia em Camada Delgada (CCD). Análise bioautográfica das placas de CCD permitiu identificar as frações com atividade antimicrobiana, que foram então analisadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Ensaios in vitro freqüentemente utilizados para avaliar a atividade de própolis frente a bactérias Gram-positivas foram comparados para determinar qual renderia os resultados mais consistentes. A atividade bactericida destes extratos foi analisada por Diluição Seriada em Tubos e por testes de Difusão em Agar. O método de Diluição em Tubos permitiu obter os resultados mais consistentes e a Concentração Bactericida Mínima dos extratos variou entre 2,5 e 20,0 mg/mL, para as espécies de bactérias Gram-positivas testadas. Os resultados do método de Difusão em Agar foram diretamente proporcionais à hidrossolubilidade dos extratos, e não avaliaram a atividade bactericida corretamente. A atividade bactericida desta amostra resultou da combinação de vários componentes, identificados por CLAE, que foram extraídos preferencialmente usando etanol 50% como solvente.

Atividade antimicrobiana do extrato bruto etanólico de raízes e partes aéreas de Ottonia martiana Miq. (Piperaceae) / Antimicrobial activity of crude ethanolic extracts of Ottonia martiana Miq. (Piperaceae) roots and aerial parts

Ottonia martiana Miq., Piperaceae, conhecida na medicina popular brasileira como "anestésia", é um arbusto característico da Floresta Atlântica. Devido à ação anestésica sobre a mucosa oral, raízes e partes aéreas são popularmente utilizadas em dores de dente, na forma de alcoolaturas (bochechos) ou pela mastigação de fragmentos de partes da planta. Como os microrganismos estão adquirindo resistência aos antibióticos tradicionais, a procura por novos agentes antimicrobianos, a partir de plantas, vem sendo intensificada. Nesta perspectiva, avaliou-se o efeito antimicrobiano do extrato bruto etanólico dos órgãos totais desta espécie (EBEtOH) frente às bactérias Enterococcus faecium (ATCC 6569), Enterobacter aerogenes (ATCC 13048) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442), utilizando-se os métodos de difusão em ágar e bioautografia. Os resultados obtidos por difusão em ágar mostraram que o EBEtOH de O. martiana apresenta potencial antibacteriano contra E. faecium, evidenciado pelo aparecimento de zonas de inibição de crescimento no respectivo bioautograma e não demonstraram ação antimicrobiana contra as outras cepas testadas.

Ottonia martiana Miq., Piperaceae, known in Brazilian folk medicine as "anestésia", is an herbaceous shrub found in Atlantic Tropical Forest. Due to its anesthetic action on the mucous membranes of the mouth, roots and aerial parts are commonly used to relief toothache, usually as alcoholic macerates (mouth washing) or by chewing parts of the plant. As most microorganisms are acquiring resistance to traditional antibiotics, the search for new antimicrobials agents, specially from plants, is being intensified. Based on this, the activity of the crude ethanolic extract from roots and aerial parts (EBEtOH) of O. martiana against Enterococcus faecium (ATCC 6569), Enterobacter aerogenes (ATCC 13048) and Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442) was evaluated using the agar difusion and bioautographic methods. Results from the agar diffusion assay showed that O. martiana EBEtOH has a potencial effect against E. faecium, which was corroborated by the presence of inhibition zones in the bioautographic test, whereas no inhibitory action against the other assayed bacteria was observed.