Análise de marcadores sanguíneos em pacientes com osteossarcoma, sarcomas de partes moles e tumor desmóide / Analysis of blood markers in patients with soft tissue sarcoma and desmoid tumor

Introdução: O tumor desmoide (TD) é uma neoplasia rara com altas taxas de recorrência local, composto por células fibroblásticas que se caracterizam pela expressão de moléculas-chave, incluindo o filamento intermediário vimentina, ciclooxigenase-2 (COX-2) e ß-catenina nuclear. Células tumorais circulantes (CTCs) isoladas do sangue periférico de pacientes com sarcomas e outras neoplasias podem ser utilizadas como biomarcadores precoces de invasão e disseminação tumoral. A família dos Receptores do Fator de Crescimento Epidérmico (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) também podem influenciar no processo de invasão das CTCs, na formação de metástases e na recolonização de seus tumores de origem por meio de um processo de "auto-semeadura do tumor". Objetivo: Nosso objetivo foi identificar CTCs no sangue periférico de pacientes com TD ou sarcomas e avaliar a expressão das proteínas ß-catenina, TGF-ßRI (do Inglês, Transforming Growth Factor-ß Receptor I), COX-2 (Cyclooxygenase2), vimentina, GLUT-1 (Glucose Transporter 1), LGR5 (G-Protein Coupled Receptor 5) e EGFR, e sua correlação com sobrevidas global (SG) e livre de progressão (SLP). Materiais e Métodos: Foi realizado um estudo prospectivo de pacientes com diagnóstico inicial ou TD recidivado com doença mensurável. Para sarcomas, utilizamos amostras coletadas de forma prospectiva e retrospectiva. As amostras de sangue de cada paciente foram processadas e filtradas pelo ISET® (Rarecells, França) para isolamento e quantificação de CTCs. A expressão das proteínas foi analisada por imunocitoquímica (ICC). Para análise molecular das CTCs provenientes de pacientes com TD foi padronizado o método de PCR digital. Resultados: Foram incluídos 18 pacientes com TD, todos com CTCs detectáveis, com níveis que variaram entre 0,5­13 CTCs/mL. Encontramos uma concordância da expressão de ß-catenina em CTCs e tumores primários de 42,8% (6/14) dos casos usando ICC e imunohistoquímica, respectivamente. Nos nossos testes prévios de PCR digital, encontramos cópias mutadas de S45Pro em 4 pacientes (40%) e de S45Phe em apenas um paciente (10%). Em contraste, não foram encontradas mutações Th41Ala. Nas amostras de sarcomas, analisamos 30 amostras e encontramos CTCs em 93% dos pacientes e os níveis variaram de 0-11,25 CTCs/mL. Observamos também que a SG dos pacientes positivos para EGFR (p=0,027) eram inferiores às sobrevidas dos pacientes negativos para as mesmas proteínas. Conclusões: Nosso estudo identificou alta prevalência de CTCs em pacientes com TD e sarcomas. A concordânciada expressão de ß-catenina entre tumor primário e CTCs traz novas perspectivas para avaliar a dinâmica das CTCs no compartimento sanguíneo, abrindo novos caminhos para o estudo da biologia e comportamento do TD. Este é o primeiro estudo a demonstrar a expressão da proteína LGR5 em CTCs de pacientes com diferentes tipos de sarcomas, o que pode abrir novas oportunidades para futuras investigações. O próximo passo é caracterizar CTCs em uma coorte maior de pacientes para entender melhor o papel do LGR5 e das demais proteínas no processo de metástases tumorais em sarcomas. Além disso, esses resultados abrem a possibilidade de usar CTCs para prever a dinâmica do TD no momento da progressão da doença e tratamento. Mais estudos com tamanhos de amostra maiores são necessários para validar nossos achados tanto em TD como em sarcomas

Introduction: Desmoid tumor (DT) is a rare neoplasm with high rates of local recurrence, composed of fibroblast cells that are characterized by the expression of key molecules, including the intermediate filament vimentin, cyclooxygenase-2 (COX-2) and ß-catenin. Circulating tumor cells (CTCs) isolated from the peripheral blood of patients with sarcomas and other neoplasms can be used as early biomarkers of tumor invasion and dissemination. The Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) family can also influence the process of CTC invasion, metastasis formation and recolonization of their tumors of origin through a process of "tumor selfseeding". Objective: Our objective was to identify CTCs in the peripheral blood of patients with TD or sarcomas and to evaluate the expression of ßcatenin proteins, transforming growth factor receptor beta I (TGF-ßRI), COX-2 (cyclooxygenase-2), vimentin, GLUT-1 (Glucose transporter 1), LGR5 (Gprotein coupled receptor 5) and EGFR and their relation with progression free (PFS) and overall suvival (OS). Methods: We performed a prospective study of patients with initial diagnosis or relapsed TD with measurable disease. For sarcomas, we used samples collected prospectively and retrospectively. Blood samples from each patient were processed and filtered by ISET® (Rarecells, France) for isolation and quantification of CTCs. Protein expression was analyzed by immunocytochemistry (ICC). For the molecular analysis of CTCs from patients with TD, the digital PCR method was standardized. Results: Eighteen TD patients were included, all with detectable CTCs, with levels ranging from 0.5­13 CTCs/mL. We found a concordance ofß-catenin expression in CTCs and primary tumors of 42.8% (6/14) of cases using ICC and immunohistochemistry, respectively. In our previous digital PCR tests, we found mutated copies of S45Pro in 4 patients (40%) and of S45Phe in only one patient (10%). In contrast, no Th41Ala mutations were found. In the sarcoma samples, we analyzed 30 samples and found CTCs in 93% of the patients and the levels ranged from 0-11.25 CTCs/mL. We also observed that the OS of EGFR positive patients (p=0.027) were lower than the survival of negative patients for the same proteins. Conclusions: Our study identified a high prevalence of CTCs in patients with TD and sarcomas. The agreement of ß-catenin expression between primary tumor and CTCs brings new perspectives to evaluate the dynamics of CTCs in the blood compartment, opening newavenues for the study of the biology and behavior of TD. This is the first study to demonstrate the expression of LGR5 protein in CTCs from patients with different types of sarcomas, which may open new opportunities for future investigations. The next step is to characterize CTCs in a larger cohort of patients to better understand the role of LGR5 and other proteins in the process of tumor metastases in sarcomas. Furthermore, these results open up the possibility of using CTCs to predict the dynamics of TD at the time of disease progression and treatment. More studies with larger sample sizes areneeded to validate our findings in both TD and sarcomas

The combination of mammaglobin A and TWIST-1 increases detection of circulating tumor cells in breast cancer / A combinação de mamaglobina A e TWIST-1 aumenta a detecção de células tumorais circulantes no câncer de mama

ABSTRACT Objectives: Breast cancer cells that are released into the bloodstream are called circulating tumor cells (CTCs). CTCs can express different genes, like TWIST-1 and mammaglobin A (MGA). The aims of this study were to analyze the expression of TWIST-1 and MGA in the blood of breast cancer patients to detect CTCs and to assess the association between the presence of CTCs and prognostic parameters of breast cancer. Methods: Prospective study. Total ribonucleic acid (RNA) from blood mononucleated cells was obtained from breast cancer patients (n = 36; age: 51.5 ± 12.5 years) and healthy donors (n = 14; age: 49.4 ± 9.4 years). Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed to analyze the expression of TWIST-1 and MGA. Results: Patient carcinomas - ductal (86.7%), other types (13.3%). MGA gene expression was not detected in the donors' samples, while it was detected in 14% of the patient samples. Overexpression of TWIST-1 gene was observed in 17% of the patient samples. The combined analysis of both markers allowed the detection of CTCs in 27.8% of the samples, resulting in a significant (p < 0.05) sensitivity increase of detection. No significant associations (p > 0.05) were found between expression of the analyzed genes and the breast cancer prognostic factors. Conclusion: Combined analysis of TWIST-1 and MGA increased the sensitivity of CTCs detection compared to the single analysis of each gene. The detection of CTCs was not associated with known prognostic factors, suggesting that it is able to provide clinical information in addition to routine breast cancer clinicopathological parameters.

RESUMEN Objetivos: Las células de cáncer de mama liberadas al torrente sanguíneo se llaman células tumorales circulantes (CTCs). Las CTCs pueden expresar diferentes genes, como TWIST-1 y mamaglobina A (MGA). Los objetivos de este estudio fueron analizar la expresión de TWIST-1 y MGA en la sangre de pacientes con cáncer de mama (CM) para detectar CTCs y evaluar la asociación entre la presencia de CTCs y los parámetros pronósticos del CM. Métodos: Estudio prospectivo. Se obtuvo el ácido ribonucleico (ARN) de las células mononucleadas en la sangre de pacientes con CM (n = 36, edad: 51,5 ± 12,5 años) y donantes sanas (n = 14; edad: 49,4 ± 9,4 años). Se realizó reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) para analizar la expresión de TWIST-1 y MGA. Resultados: Carcinoma ductal (86,7%), otros tipos (13,3%). No se detectó la expresión del gen MGA en las muestras de las donantes, pero en el 14% de las muestras de las pacientes. Se observó elevada expresión de TWIST-1 en el 17% de las muestras de pacientes con CM. El análisis combinado de ambos marcadores permitió detección de CTCs en el 27,8% de las muestras, resultando en un aumento significativo (p < 0,05) en la sensibilidad de detección. No se encontraron asociaciones significativas (p > 0,05) entre la expresión de los genes y los factores pronósticos. Conclusión: El análisis combinado de TWIST-1 y MGA aumentó la sensibilidad de detección de CTCs en comparación con el análisis de cada gen. La detección de CTCs no se asoció a factores pronósticos conocidos, sugiriendo que podría ofrecer informaciones clínicas adicionales a los parámetros clínico-patológicos de rutina del CM.

RESUMO Objetivos: As células cancerígenas da mama liberadas na corrente sanguínea são chamadas de células tumorais circulantes (CTCs). As CTCs podem expressar diferentes genes, como TWIST-1 e mamaglobina A (MGA). Os objetivos deste estudo foram analisar a expressão de TWIST-1 e MGA no sangue de pacientes com câncer da mama (CM) para detectar CTCs e avaliar a associação entre a presença de CTCs e os parâmetros prognósticos do CM. Métodos: Estudo prospectivo. O ácido ribonucleico (RNA) das células mononucleadas no sangue foi obtido de pacientes com CM (n = 36, idade: 51,5 ± 12,5 anos) e doadoras saudáveis (n = 14; idade: 49,4 ± 9,4 anos). Reação da cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) foi realizada para analisar a expressão de TWIST-1 e MGA. Resultados: Carcinoma ductal (86,7%), outros tipos (13,3%). A expressão do gene MGA não foi detectada nas amostras das doadoras, mas foi observada em 14% das amostras das pacientes. Superexpressão de TWIST-1 foi observada em 17% das amostras dos indivíduos com CM. A análise combinada de ambos os marcadores permitiu a detecção de CTCs em 27,8% das amostras, resultando em um aumento significativo (p < 0,05) na sensibilidade da detecção. Associações significativas (p > 0,05) entre a expressão dos genes e os fatores prognósticos não foram encontradas. Conclusão: A análise combinada de TWIST-1 e MGA aumentou a sensibilidade da detecção de CTCs em comparação com a análise de cada gene. A detecção de CTCs não foi associada a fatores prognósticos conhecidos, sugerindo que ela pode fornecer informações clínicas adicionais aos parâmetros clinicopatológicos de rotina do CM.