Diagnosis of canine leptospirosis: evaluation of two PCR assays in comparison with the microagglutination test / Diagnóstico de leptospirose canina: avaliação de dois ensaios de PCR em comparação com o teste de microaglutinação

Canine leptospirosis is definitely diagnosed by demonstrating seroconversion in paired serum samples from the acute and convalescent period by the microagglutination test (MAT). However, the application of a polymerase chain reaction (PCR) assay can provide earlier confirmation of suspected cases. The objective of this study was to evaluate two PCR assays used in diagnosis of human leptospirosis (lipL32 real-time PCR and rrs conventional PCR) in cultured microorganisms and experimentally contaminated samples (whole blood, serum, urine), and investigate their applicability in clinical samples from dogs with presumptive diagnosis of leptospirosis by using the MAT as a reference. The analytical sensitivity of the lipL32 real-time PCR was 1 genome equivalent per reaction, whereas that for the rrs conventional PCR was 10 genome equivalents per reaction. Both assays amplified the pathogenic strains but were negative when evaluating the DNA of other microorganisms that may be present in clinical samples. The lipL32 real-time PCR detected 100 bacteria/mL in whole blood samples, 1000 bacteria/mL in serum samples and 10 bacteria/mL in urine samples, whereas the rrs conventional PCR detected 1000 bacteria/mL in whole blood and serum samples and 100 bacteria/mL in urine samples. Seven out of the 51 samples from dogs with presumptive diagnosis of leptospirosis were considered as confirmed cases. ThelipL32 real-time PCR detected positive results in six of the seven confirmed cases, whereas the rrs conventional PCR detected four. The PCR assays evaluated proved to be useful diagnostic tools in the confirmation of canine leptospirosis when used together with the MAT.(AU)

O diagnóstico definitivo da leptospirose canina é geralmente realizado demonstrando a seroconversão em amostras do paciente no período agudo e de convalescença por serologia. No entanto, a aplicação de técnicas de PCR pode contribuir para a confirmação de casos suspeitos num período de tempo mais curto. O objetivo deste estudo foi avaliar dois ensaios de PCR publicados em humanos (PCR-lipL32 em tempo real e PCR-rrs convencional) em culturas puras e em amostras de sangue com anticoagulante, soro e urina experimentalmente contaminados. Posteriormente, investigamos a utilidade de ambos os ensaios de PCR em amostras clínicas de cães com suspeita de leptospirose tomando a técnica de microaglutinação (MAT) como referência. A sensibilidade analítica foi de 1 e 10 genoma equivalente por reação para PCR-lipL32 em tempo real e para PCR-rrs convencional, respectivamente. Ambos os ensaios amplificaram corretamente as 14 estirpes patogênicas, mas foram negativos para avaliar o ADN de outros microrganismos que poderiam estar presentes em amostras clinicas. Em nas amostras experimentalmente contaminadas PCR-LipL32 em tempo real detectou 100 bactérias/mL em sangue total, 1000 bactérias/mL em soro e 10 bactérias/mL em urina. Enquanto o PCR-rrs convencional detectou 1000 bactérias/mL em sangue total e soro e 100 bactérias/mL na urina. Dos 51 cães suspeitos, sete foram considerados casos confirmados pela MAT. O PCR-lipL 32 em tempo real detectou seis dos sete casos confirmados, enquanto o PCR-rrs convencional foi positivo em quatro deles. As técnicas de PCR avaliadas provaram ser uma ferramenta de diagnóstico útil na confirmação de casos clínicos caninos quando utilizados em conjunto com a técnica MAT.(AU)

Prevalence and risk factors to Leptospira sp. infection in dogs attended at veterinary clinics in João Pessoa, Paraíba State, Northeastern Brazil / Prevalência e fatores de risco da infecção por Leptospira sp. em cães atendidos em clínicas veterinárias em João Pessoa, Paraíba, Nordeste do Brasil

This study investigated the prevalence and risk factors associated with Leptospira sp. in dogs attended at veterinary clinics in the city of João Pessoa, State of Paraíba, Northeast Brazil. A total of 384 blood samples from dogs from 34 veterinary clinics were used from April 2015 to May 2016. The serological Leptospira sp diagnosis was carried out through Microscopic Agglutination Test (MAT), using a collection of 20 pathogenic antigens and adopting a 1:100 dilution as cutoff point. An epidemiological questionnaire was applied to the animal's owners to obtain the information used in risk factors analysis. The prevalence of seropositive animals was 11.7% (45/384), with reactions for serogroups Icterohaemorrhagiae (62.3%), Grippotyphosa (22.2%), Canicola (13.3%), Djasiman 2%) and Pomona (2.2%). The following risk factors were identified: age from 49 to 72 months (odds ratio = 2.74); Age > 72 months (odds ratio = 3.22); and monthly cleaning of the environment where the animals were kept (odds ratio = 10.70). We concluded that dogs attended at veterinary clinics in João Pessoa are exposed to Leptospira sp infection, with predominance of serogroups kept by wild or synanthropic animals, and suggest a monthly periodic environment cleaning where the animals are kept.(AU)

O presente trabalho investigou a prevalência e os fatores de risco associados à infecção por Leptospira sp. em cães atendidos em clínicas veterinárias da cidade de João Pessoa, Estado da Paraíba, Nordeste do Brasil. Foram utilizadas 384 amostras sanguíneas de cães provenientes de 34 clínicas veterinárias no período de abril de 2015 a maio de 2016. O diagnóstico da infecção por Leptospira sp. foi realizado com o emprego reação de Soroaglutinação Microscópica (SAM), utilizando uma coleção com 20 antígenos patogênicos e adotando como ponto de corte a diluição 1:100. Foi aplicado um questionário epidemiológico aos proprietários dos animais para obtenção de dados a serem utilizados na análise de fatores de risco. A prevalência de animais soropositivos foi de 11,7% (45/384), com reações para os sorogrupos Icterohaemorrhagiae (62,3%), Grippotyphosa (22,2%), Canicola (13,3%), Djasiman (2,2%) e Pomona (2,2%). Foram identificados os seguintes fatores de risco: idade entre 49 e 72 meses (odds ratio = 2,74), idade maior que 72 meses (odds ratio = 3,22), e limpeza mensal do ambiente onde os animais permanecem (odds ratio = 10,70). Conclui-se que cães atendidos em clínicas veterinárias de João Pessoa estão expostos à infecção por Leptospira sp., com predominância de sorogrupos mantidos por animais selvagens, e foi sugerida a realização da limpeza periódica do ambiente ocupado pelos animais.(AU)

Diagnosis of canine leptospirosis using an immunomagnetic separation-PCR method

Diagnosis of leptospirosis by PCR is hampered due to the presence of substances on biological fluids. Here, we report an immunomagnetic separation step prior to PCR which improved the detection of Leptospira spp. in blood and urine samples from dogs. It resulted in a significant improvement on sensitivity for diagnosis of canine leptospirosis.