Avaliação da aplicabilidade de polímeros sintéticos na vitrificação de tecido ovariano bovino / Evaluation of the applicability of synthetic polymers in the vitrification of bovine ovarian tissue

A preservação da fertilidade em pacientes com câncer objetiva assegurar a saúde reprodutiva. A criopreservação de tecido ovariano é a única técnica disponível para meninas pré-púberes e para casos em que o tratamento não pode ser adiado. A técnica de vitrificação está associada a uma melhor preservação de fragmentos do córtex ovariano quando comparada ao congelamento lento. Estudos preliminares demonstraram que a combinação de polímeros sintéticos na vitrificação preservou melhor o tecido e os folículos secundários no córtex de ovários de macacos, por serem miméticos às proteínas naturais responsáveis pela proteção conferida a alguns organismos durante o inverno. A técnica de vitrificação associada a polímeros sintéticos é uma alternativa promissora, mas ainda não está disponível um protocolo padrão que demonstre resultados consistentes. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar a aplicabilidade de polímeros sintéticos na criopreservação por vitrificação de tecido ovariano bovino. Ovários bovinos foram obtidos a partir de animais abatidos para consumo em um abatedouro local. O córtex foi extraído e cortado em fragmentos. Os fragmentos foram divididos em três grupos (controle fresco, vitrificação com (CP) e sem (SP) adição de polímeros sintéticos). Os fragmentos de tecido de todos os grupos antes e após aquecimento foram fixados em paraformaldeído a 4%, corados com hematoxilina e eosina para avaliação de morfologia, contagem e observação do estágio folicular. Parte dos fragmentos tiveram seus folículos secundários isolados mecanicamente e cultivados em matriz de alginato até atingirem o estágio antral. Durante o cultivo, para análise de viabilidade, foram avaliados a sobrevida, crescimento e formação de antro folicular. Para avaliação da funcionalidade folicular, o meio de cultivo foi coletado para posterior dosagem de esteróides ovarianos. Então, os três grupos foram comparados estatisticamente. Os tecidos ovarianos vitrificados apresentaram uma morfologia com sinais de injúria, com espaços vazios e menos densos, além de exibirem uma menor porcentagem de folículos normais quando comparados ao tecido fresco (Fresco x CP p<0,0001; Fresco x SP p=0,0004). Contudo, não foi observada diferença entre os grupos vitrificados com e sem polímeros (CP x SP p = 0,7173). Os folículos que passaram pela vitrificação apresentaram uma sobrevida similar entre si e menor que o controle fresco (χ²(2) = 19,87; p< 0,0001). Todos os grupos avaliados foram semelhantes na taxa de formação de antro (χ²(1) = 0,6569; p< 0,4176). Em todos os grupos houve crescimento folicular durante o cultivo. No entanto, os folículos frescos e com adição de polímeros aumentaram de diâmetro durante todo o cultivo, ao passo que os folículos sem adição de polímeros cresceram apenas na primeira semana. No fim do cultivo, os folículos que passaram pelo processo de vitrificação produzem menos hormônios que os frescos (p < 0,05), mas sem diferença entre SP e CP. A partir desses resultados, é possível concluir que a combinação do uso de polímeros sintéticos na vitrificação de tecido ovariano é uma técnica promissora, que poderá proteger o desenvolvimento folicular, mas são necessários mais estudos que possam aperfeiçoar esse protocolo.

The preservation of fertility in cancer patients aims to ensure reproductive health. Ovarian tissue cryopreservation is the only technique available for prepubescent girls and for cases where treatment cannot be delayed. The vitrification technique is associated with better preservation of ovarian cortex fragments when compared to slow freezing. Preliminary studies in the cortex of monkeys' ovaries have shown that the combination of synthetic polymers in vitrification is better to preserve the tissue and secondary follicles, as they are mimetic to the natural proteins responsible for the protection during the winter in some organisms. The vitrification technique associated with synthetic polymers is a promising alternative, but a standard protocol that demonstrates consistent results is not yet available. Thus, this work aimed to evaluate the applicability of synthetic polymers in cryopreservation by vitrification of bovine ovarian tissue. Bovine ovaries were obtained at a local abattoir. The cortex was extracted and cut into fragments. The fragments were divided into three groups (fresh control, vitrification with (CP) and without (SP) addition of synthetic polymers). Tissue fragments from all groups before and after heating were fixed in 4% paraformaldehyde, stained with hematoxylin and eosin for morphology assessment, counting and observation of the follicular stage. Part of the fragments had their secondary follicles mechanically isolated and cultivated in alginate matrix until they reached the antral stage. During cultivation, for viability analysis, survival, growth and follicular antrum formation were evaluated. To evaluate the follicular functionality, the culture medium was collected for later measurement of ovarian steroids. The vitrified ovarian tissues presented a morphology with signs of injury, with empty and less dense spaces, in addition to showing a lower percentage of normal follicles when compared to fresh tissue (Fresh control x CP p< 0.0001). All groups evaluated were similar in the rate of antrum formation (χ²(1) = 0.6569; p< 0.4176). In all groups there was follicular growth during cultivation. However, fresh and polymer-added follicles increased in diameter throughout the cultivation, whereas follicles without polymer additions grew only in the first week. At the end of cultivation, the follicles that underwent the vitrification process produced less hormones than the fresh ones (p < 0.05), but there was no difference between SP and CP. From these results, it is possible to conclude that the combination of the use of synthetic polymers in the vitrification of ovarian tissue is a promising technique, which may protect follicular development, but further studies are needed to improve this protocol.

Vitrificación de ovocitos y pacientes con cáncer

El incremento del uso de la criopreservación de ovocitos empieza después de la introducción de la técnica de vitrificación y el nacimiento del primer bebe logrado con este método en 1999. Usando esta poderosa herramienta, los científicos han ayudado a las mujeres a criopreservar sus gametos ya sea a través de la vitrificación de ovocitos o de corteza ovárica. Durante una década, fuertes avances en la tecnología de la vitrificación han mejorado la eficiencia clínica y sus resultados. Con estos avances se ha reducido la dependencia de la habilidad del operador y se ha elevado la tasa de éxito a niveles altos y homogéneos. Como resultado, la vitrificación se ha vuelto confiable y la tendencia actual está mostrando un incremento definitivo en su uso en comparación de la congelación lenta. El nuevo y avanzado método conocido como 'Método Cryotech' asegura que se logre 100% de viabilidad en ovocitos y embriones en cualquier estadio. La técnica se establece para asegurar y definir cambios en la técnica de criopreservación en el mundo entero. Debido al gran efecto emocional que causa el diagnóstico de cáncer y la necesidad de su inmediato tratamiento, los potenciales efectos gonadotóxicos del cáncer o de este tratamiento no son normalmente discutidos a la hora del diagnóstico. La preservación de la fertilidad es un reciente esfuerzo y muchos pacientes con cáncer y trabajadores de salud no están familiarizados con el desarrollo rápido que ha tenido tanto en la parte de investigación como en la implementación en la práctica clínica. Se han establecido algunas técnicas de preservación de fertilidad como la vitrificación de ovocitos y otros como vitrificación de corteza ovárica que ha sido validada en los últimos 5 años con niños saludables nacidos sin tratamiento de fertilidad, incluso cuando aún siguen considerándose casos experimentales. Combinando todos los conocimientos que ahora tenemos sobre vitrificación de ovocitos y corteza ovárica con la estimulación hormonal del ovario incluso en la fase lútea y la efectividad del proceso de la reproducción asistida, podemos afirmar que es posible preservar vidas reproductivas de pacientes con cáncer incluso en pacientes pediátricos.

The increase in the use of oocyte cryopreservation occurred after the introduction of the vitrification technique and the birth of the first baby with this method in 1999. Using this powerful tool, scientists have helped women to cryopreserve their gametes by oocyte or ovarian cortex vitrification. For a decade, important advances in vitrification technology have improved clinical efficiency and results. This progress has reduced the dependence on the operator skill and has increased the success rate to high and homogeneous levels. As a result, vitrification has become reliable and the current trend shows a definite increase in its use compared to slow freezing. The new and advanced method known as â€oeCryotech method” ensures achievement of 100% viability in oocytes and embryos at any stage. The technique is set to make definite changes in the procedure of cryopreservation in the whole world. Due to the great emotional effect caused by cancer diagnosis and the need for immediate treatment, the potential gonadotoxic effects of cancer or its treatment are not normally discussed at the time of diagnosis. Fertility preservation is a recent effort, and many cancer patients and health workers are not familiar with its rapid development on research and on implementation in clinical practice. Some techniques of fertility preservation as oocyte or ovarian cortex vitrification have been validated in the past 5 years with healthy children born without fertility treatment, even when these continue to be experimental cases. Combining all the knowledge we now have on oocytes and ovarian cortex vitrification with hormonal stimulation of the ovary even in the luteal phase and the effectiveness of the process of assisted reproduction, we can say that it is possible to preserve reproductive lives of patients with cancer even in pediatric patients.

Preservación de la fertilidad en la mujer / Fertility preservation in female patients

Hay ocasiones en que la capacidad de ser madre de una mujer se ve amenazada. La preservación de la fertilidad se refiere a las intervenciones médicas y/o quirúrgicas destinadas a proteger la fertilidad de estas pacientes y se utilizan especialmente en mujeres con cáncer que van a requerir un tratamiento que puede provocar una falla de la función ovárica. A diferencia de los hombres adultos, en la mujer existen relativamente pocas opciones clínicas para preservar la fertilidad, especialmente si se va a someter a un tratamiento agresivo con quimioterapia y/o radioterapia. La criopreservación embrionaria es, en la actualidad, la alternativa más probada y con mayores tasas de efectividad. La transposición ovárica antes de la radioterapia también es un método probado. Sin embargo, el resto de estos tratamientos son todavía experimentales y su eficacia y fiabilidad aún no han sido bien determinadas. La preservación de la fertilidad es especialmente desafiante en las niñas, ya que en ellas la criopreservación embrionaria u ovocitaria no es posible. El objetivo de este artículo es revisar los avances actuales en las estrategias para preservar la fertilidad en la mujer con énfasis en la criopreservación de tejido ovárico y crear conciencia de que el futuro de estas distintas técnicas es promisorio.

The preservation of fertility in women refers to medical and or surgical interventions aimed at protecting a woman's capacity of nurturing a child when her fertility is threatened. They are most commonly used in women with diagnosis of cancer who require treatment that may result in failure of ovarian function. As opposed to adult males, women have limited clinical alternatives for preserving fertility, especially in cases where aggressive cancer treatment with chemotherapy and/or radiotherapy is required. Embryo cryopreservation is at present the most established and effective alternative. Another proven method is ovarian transposition prior to radiotherapy. Other treatments are still experimental and their efficacy and reliability have not yet been determined. The preservation of fertility is especially challenging in girls, in whom embryo or oocyte cryopreservation is not possible. The objective of this article is to review the current advances in fertility preservation strategies and to discuss future directions with an emphasis on ovarian tissue cryobanking and to create conscience that the future of these different techniques is promising.

Avanços tecnológicos da criopreservação de ovócitos / Technological advances in oocytes criopreservation

Apresenta-se uma revisão atualizada sobre a criopreservação de ovócito e sua importância em reprodução assistida. O presente trabalho tem como ênfase vantagens e desvantagens dos métodos utilizados para congelamento de gametas, efeito dos crioprotetores intracelulares e extracelulares, além da aplicabilidade da técnica na fertilidade feminina e na manutenção da biodiversidade animal.

It presents an updated review of oocyte cryopreservation and its importance in assisted reproduction. Th is work has an emphasis on advantages and disadvantages of the methods used for freezing gametes, the eff ects of intracellular and extracellular cryoprotectants, and the applicability of the technique in female fertility and in maintaining animal biodiversity

Germinação de espécies arbóreas de floresta estacional decidual do vale do rio Paranã em Goiás após três tipos de armazenamento por até 15 meses / Germination of tropical dry forest tree species of Paranã river basin, Goiás state, after three types of storage and up to 15 months

Em florestas deciduais a dispersão de sementes ocorre principalmente na estação seca e a germinação no início da estação chuvosa. O atraso das primeiras chuvas e a ocorrência de veranicos são importantes causas de mortalidade de sementes e plântulas. Armazenar sementes e plantá-las na estação chuvosa poderia aumentar a germinação e a sobrevivência de plântulas. Para isso é necessário verificar se as sementes mantêm sua germinabilidade após armazenamento. No presente estudo, investigamos se sementes de espécies arbóreas de floresta decidual alteram sua germinabilidade após i) serem armazenadas em condições naturais por três e 15 meses, e ii) em banco de germoplasma a -20 e -196 ºC. Coletamos sementes de 19 espécies de florestas estacionais deciduais do vale do rio Paranã, Goiás, nos meses de agosto a outubro de 2005. Um lote foi separado para a realização do teste de germinação, logo após a coleta. Uma quantidade deste lote permaneceu em câmaras a -20 ºC e outra foi imersa em nitrogênio liquido por 72 horas. Outros dois lotes foram armazenados em condições naturais por três e 15 meses antes do teste de germinação. Após três meses de armazenamento, apenas duas espécies, Cordia trichotoma (73 para 38 por cento) e Copaifera langsdorffii (85 para 65 por cento), reduziram sua germinabilidade. Após 15 meses, três espécies reduziram significativamente sua germinabilidade, Cordia trichotoma (73 para 5 por cento), Cavanillesia arborea (77 para 12 por cento) e Anadenanthera colubrina (93 para 76 por cento), e duas espécies, Aspidosperma pyrifolium e Tabebuia impetiginosa, perderam completamente sua germinabilidade. As temperaturas -20 e -196ºC reduziram a germinabilidade de uma espécie cada, Tabebuia impetiginosa (90 para 70 por cento) e Aspidosperma pyrifolium (90 para 43 por cento), respectivamente. O ambiente natural e o armazenamento a -20 e -196ºC se mostraram eficazes quanto à preservação das qualidades fisiológicas de sementes de grande parte...

Seed dispersal in tropical deciduous forests occurs mostly in the dry season and germination at the onset of the rainy season. The delay of the first rains and dry spells are major mortality factors in dry forest regions. Storing seeds to plant during the constant rains could increase germination and seedling survival. We investigated the germination percentage of deciduous forest tree species after being stored i) at -20 ºC and -196 ºC (liquid nitrogen), and ii) at natural conditions for three and 15 months. Seeds of 19 tree species of deciduous forests of Paranã river basin, Goiás state, were collected from August to October 2005. Two experiments were run: i) storage for three and 15 months in brown bags at environmental temperature, ii) storage for 72 hours at -20 ºC cameras, liquid nitrogen (-196 ºC) and a control. Storage at environmental temperature decreased germination of only two species after three months, Cordia trichotoma (73 to 38 percent) and Copaifera langsdorffii (85 to 65 percent). Three species decreased germination after 15 months (Cordia trichotoma, 73 to 5 percent; Cavanillesia arborea, 77 percent to 12 percent; and Anadenanthera colubrina, 93 percent to 76 percent) and two species, Aspidosperma pyrifolium and Tabebuia impetiginosa, lost completely their germination. Temperatures -20 and -196 ºC decreased germination of only one species each, Tabebuia impetiginosa (90 to 70 percent) and Aspidosperma pyrifolium (90 to 43 percent), respectively. In general, environmental temperature storage up to 15 months and -20 and -196 ºC storage were efficient to preserve seed germinability of many dry forest tree species from Paranã river basin. These are feasible options to ex situ conservation and to increase germination for direct seeding strategies of restoration.