Técnicas de substituição de DNA mitocondrial para reduzir a transmissão da Síndrome de Leigh / Mitochondrial DNA replacement techniques to reduce Leigh syndrome transmission

A Síndrome de Leigh (SL) é uma doença neuro-metabólica congênita, que faz parte do grupo das encefalopatias fatais, com progressão e morte dentro de 2 anos, em média. A SL é causada por mutações no DNA que causam alterações na geração de ATP celular pelas mitocôndrias. As mitocôndrias contêm seu próprio DNA (mtDNA) e, ao contrário do DNA nuclear, o mtDNA é herdado somente da mãe. Mulheres portadores de mutações causadoras da SL podem vivenciar experiências muito tristes ao tentarem realizar o sonho da maternidade. As técnicas de substituição de mtDNA mutado com mtDNA saudável de doadora, oferecem a essas mulheres a possibilidade de terem uma criança geneticamente relacionada sem a SL. O desenvolvimento e a aplicação clínica de terapias de substituição de mtDNA já são uma realidade, tendo o primeiro bebê gerado a partir da técnica nascido em 2016. Mas será que essas técnicas são seguras? Neste trabalho, revisamos a SL e algumas técnicas de substituição de mtDNA já aplicadas em humanos, que envolvem a transferência de pronúcleos de zigotos ou de fuso acromático de oócitos. Concluímos que, apesar dos resultados promissores, ainda é cedo para assegurar a aplicabilidade clínica de técnicas de substituição de mtDNA em seres humanos. (AU)

Leigh syndrome (SL) is a congenital neurometabolic disease included in the group of fatal encephalopathies, with progression and death within 2 years on average. SL is caused by mutations in the DNA that cause changes in the generation of cellular ATP by mitochondria. Mitochondria contain their own DNA (mtDNA) and, unlike nuclear DNA, mtDNA is inherited only from the mother. Women with SL mutations may experience mournful situations when attempting to fulfill the dream of motherhood. Techniques for replacing mutant mtDNA with healthy donor mtDNA provide these women with the possibility of having a genetically related child without SL. The development and clinical application of mtDNA replacement therapies is a reality, and the first baby generated using the technique was born in 2016. However, are these techniques safe? In this article, we review SL and some mtDNA replacement techniques that have been used in humans, which involve zygote pronuclear transfer or oocyte spindle transfer. We conclude that, despite the promising results, it is too early to ensure that mtDNA replacement techniques are clinically applicable to humans. (AU)

The advances and new technologies for the study of mitochondrial diseases / Avanços e novas tecnologias para o estudo das doenças mitocondriais

ABSTRACT Genetic mitochondrial disorders are responsible for the most common inborn errors of metabolism, caused by mutations in either nuclear genes or in mitochondrial DNA. This article presents the prokaryotic origin of the organelle and the relation between nuclear and mitochondrial genomes, as well as current evolutionary models for such mechanisms. It also addresses the structure of mitochondrial genes, their expression pattern, clinical features of gene defects, risk of transmission and current techniques to avoid these events in assisted human reproduction. Finally, it discusses the ethical implications of these possibilities.

RESUMO As doenças genéticas mitocondriais são responsáveis pelos erros inatos do metabolismo mais comuns, causados por mutações tanto em genes nucleares como no DNA mitocondrial. Este artigo apresenta a origem procariótica dessa organela, e a relação entre os genomas nuclear e mitocondrial, bem como modelos evolutivos correntes para esses mecanismos. Também trata da estrutura dos genes mitocondriais, seu padrão de expressão, características clínicas de defeitos genéticos, riscos de transmissão e técnicas atualmente utilizadas para evitar esses eventos em reprodução humana assistida. Finalmente, discute as implicações éticas dessas possibilidades.

A tecnologia time-lapse pode predizer a qualidade embrionária antes dos resultados do PGD (diagnósticogenético pré-implantacional)? / Technology time-lapse can predict embryo quality of results before PGD(pre-implantation genetic diagnosis)?

Objetivo: Verificar se há correlação entre os resultados obtidos via diagnóstico genético préimplantacional (PGD) e os dados obtidos via monitoramento em tempo real (time-lapse) durante os três dias de desenvolvimento embrionário. Método: Estudo retrospectivo no qual foram avaliados embriões de ciclos de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) de março a junho de 2012. Após a ICSI, os embriões foram colocados em incubadora vertical com monitoramento time-lapse durante três dias. A seguir os embriões foram submetidos ao PGD. Os resultados obtidos foram baseados na análise do tempo de aparecimento e desaparecimento dos dois pró-núcleos, de início da primeira e da segunda clivagem e de intervalo entre esses eventos, além da observação dos corpúsculos polares. Resultados: Dados mostraram que 84,6% dos embriões apresentaram um padrão de ciclo celular assincrônico e a inviabilidade comprovada com os resultados do PGD, 7,7% dos embriões considerados normais nos resultados do PGD mostraram ter ciclos celulares fora dos padrões e 7,7% dos embriões com ciclo celular normal apresentaram ao PGD anomalias múltiplas. As diferenças foram estatisticamente significantes para p < 0,05. Embriões com PGD normal podem apresentar um ciclo celular assincrônico, o que afeta sua implantação. Conclusões: O estudo preliminar mostra que os dados obtidos com a metodologia time-lapse, em primeiro momento, podem ser usados para avaliar a qualidade embrionária em conjunto com a avaliação morfológica deles, independentemente dos resultados do PGD, pois alterações no padrão de desenvolvimento celular embrionário parecem afetar a implantação, salvo algumas exceções. Porém, como o N amostral ainda é pequeno, necessita-se de um período maior para a certificação dos eventos observados.

Objective: Investigate whether there is correlation between results obtained with PGD and data obtained monitoring “time lapse” during 3 days of embryonic development. Method: This is a retrospective study in which we assessed embryos ICSI cycles from March to December 2012. Upon completion ICSI, embryos were placed in an incubator with vertical monitoring “time lapse” for 3 days, then embryos were subjected to PGD. The results were based on analysis of the time of appearance of two pronuclei, disappearance, the start time of first and second cleavage and intervals between these events, and the observation of polar bodies. Results: Data show that 84.6% of the embryos exhibited a pattern of cell cycle asynchronous and viability confirmed by the results of PGD, and 7.7% of embryos considered normal results of PGD, proved to have cell cycle asynchronous, 7.7% of embryos with normal cell cycle PGD showed multiple anomalies, differences were statistically significant at p < 0.05. PGD embryos with normal can present asynchronous cell cycle, affecting its implantation. Conclusion: The preliminary study shows that data obtained with method “time-lapse”, can be used to evaluate the embryo quality together with morphological evaluation same regardless outcome of PGD, because changes in pattern development of embryonic cell seem to affect development, with some exceptions. However, such as sample size remains small needs to be a longer period for certification of observed events.

Diagnóstico genético pré-implantacional e seu valor prognóstico em tecnologia de reprodução assistida: revisão da literatura / Preimplantation genetic diagnosis and its prognostic value in assisted reproduction technology: literature review

O diagnóstico genético pré-implantacional, associado a técnicas de reprodução assistida como a fertilização in vitro, permite a seleção de pré-embriões euploides para transferência. Nos últimos anos, tem sido indicado visando o aumento nas taxas de sucesso de tratamento, na sua forma de rastreio de aneuploidias para um grupo de pacientes de alto risco reprodutivo como: idade materna avançada, aborto recorrente e falhas repetidas de tratamentos. O objetivo desta revisão é avaliar o valor prognóstico da realização do diagnóstico genético pré-implantação, associado às técnicas de fertilização in vitro e injeção intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI), revisar as limitações da técnica e sua eficácia. Embora este grupo com elevado risco reprodutivo apresente alta taxa de aneuploidia, não foram encontrados dados consistentes na literatura a favor da realização do rastreio genético de aneuploidias; portanto, ainda são necessários estudos com grupos mais bem definidos para que o diagnóstico genético pré-implantacional possa ser confirmado como uma ferramenta para aumento de taxas ou como procedimento de rotina, até sua eficácia ser provada.(AU)

The preimplantation genetic diagnosis associated with assisted reproduction technology, as in vitro fertilization, allows selecting euploid pre-embryos for transfer. In recent years, it has been performed as a screening tool for aneuploidy with the purpose of increasing reproductive rates in patient populations at high risk of aneuploidy, such as: advanced maternal age, recurrent pregnancy loss and repeated in vitro fertilization failures. The aim of this review is to evaluate the prognostic value of preimplantation genetic diagnosis, associated with in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection (ICSI) techniques, to review technology?s limitations and its effectiveness. Although this high risk population group presents high rate of aneuploidy, this review has not shown consistently data in the literature in favor of preimplantation genetic screening; therefore, more studies with well-defined groups are still needed in order that preimplantation genetic diagnosis may be confirmed as a tool for increasing rates or as a routine procedure, until technique?s problems are solved and its effectiveness, proven.(AU)

Diagnóstico pré-natal das genodermatoses / Prenatal diagnosis of genodermatoses

O diagnóstico pré-natal está indicado para algumas genodermatoses graves, como a epidermólise bolhosa distrófica recessiva e a epidermólise bolhosa juncional. A biópsia de pele fetal foi introduzida em 1980, mas não pode ser realizada antes da 15a semana de gestação. A análise do DNA fetal é método preciso e pode ser realizado mais precocemente na gestação. No entanto, deve-se conhecer a base molecular da genodermatose, e é essencial determinar a mutação e/ou marcadores informativos nas famílias com criança previamente afetada. O DNA fetal pode ser obtido pela biópsia da vilosidade coriônica ou amniocentese. O diagnóstico genético pré-implantação tem surgido como alternativa que dispensa a interrupção da gestação. Essa técnica, que envolve fertilização in vitro e teste genético do embrião. vem sendo realizada para genodermatoses em poucos centros de referência. A ultra-sonografia é exame não invasivo, mas tem uso limitado no diagnóstico pré-natal de genodermatoses. A ultrasonografia tridimensional geralmente estabelece o diagnóstico tardiamente na gestação, e há apenas relatos anedóticos de diagnóstico pré-natal de genodermatoses usando esse método.

Prenatal diagnostic testing is indicated for some severe genodermatoses, such as recessive dystrophic epidermolysis bullosa and junctional epidermolysis bullosa. Fetal skin biopsy was introduced in 1980, but it cannot be performed before 15th gestational week. Fetal DNA analysis is a precise method and can be performed earlier in pregnancy. However, the molecular basis of the genodermatoses must be known and it is essential to determine the gene mutations and/or informative markers in the families with a previously affected child. Fetal DNA can be obtained by chorionic villus sampling or amniocentesis. Preimplantation genetic diagnosis is an alternative approach obviating the need for termination of pregnancy. It involves in vitro fertilization and genetic testing of embryos. However, this technique has been performed for genodermatoses in only a few reference centers. Ultrasonography is a non-invasive test, but has a limited use in prenatal diagnosis of genodermatoses. Tridimensional ultrasonography usually establishes diagnosis late in pregnancy and there are only anecdotal reports of prenatal diagnosis of genodermatoses using this method.